Одношаговая протокол для оценки режима радиационно индуцированных колониеобразования клеточной смерти по микроскопии флуоресцирования

Общая цель данного анализа заключается в оценке основных режимов клоногенной гибели клеток, индуцированной ионизирующим излучением, на основе характерной морфологии ядер, окрашенных DAPI. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области радиационной биологии. Основное преимущество этого быстрого и экономичного метода заключается в том, что основные режимы клоногенной гибели клеток, вызванной ионизирующим излучением, могут быть оценены одновременно.

Как правило, люди, не знакомые с радиационной биологией, испытывают трудности при оценке радиационно-индуцированной клоногенной гибели клеток, поскольку для оценки каждого способа клеточной смерти требуются разные анализы. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы проводили широкомасштабный скрининг радиационно-индуцированной клоногенной гибели клеток с использованием нескольких клеточных линий и доз облучения. Хотя этот метод может дать представление о радиационной биологии, он также может быть применен к другим системам, таким как химиотерапия рака.

Демонстрировать процедуру будет наш сотрудник, Ацуши Сибата. Начните со стерилизации скальпеля бумажными полотенцами, смоченными в 70% этаноле. Затем с помощью скальпеля поместите покровную пластинку в 35-миллиметровую чашку для клеточных культур.

В тарелку для закваски с крышкой кладкой добавьте один миллилитр питательной среды. Теперь аккуратно придерживайте центр крышки листом стерильными щипцами и полностью отсасывайте питательную среду из чашки. Далее приготовьте трехмиллилитровую клеточную суспензию в культуральной среде в пробирке объемом 15 миллилитров.

Добавьте клеточную суспензию в чашку для культивирования. И инкубируйте его в течение ночи при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. Убедитесь, что клетки прикреплены к покровному листку и являются живыми, рассматривая их под инвертированным фазово-контрастным микроскопом.

Теперь облучите блюдо шестью серыми рентгеновскими лучами. После облучения инкубируйте клетки в инкубаторе в течение 72 часов при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2. Теперь возьмите клетки из инкубатора и аспирируйте питательную среду из чашки для культивирования.

Отрежьте с помощью ножниц кончик микропипетки объемом 1 000 микролитров примерно в пяти миллиметрах от конца. И с его помощью добавить в чашку для культуры один миллилитр раствора фиксации. Наносите фиксирующий раствор вдоль стенок чашки для культивирования, чтобы свести к минимуму повреждение клеток.

Затем переложите эту чашку для культур в квадратную чашку для культуры и осторожно встряхните ее, чтобы равномерно распределить раствор фиксации по покровному листу. После этого выдержать блюдо в течение 10 минут при комнатной температуре. Отсадите фиксирующий раствор из чашки.

Теперь добавьте два миллилитра PBS вдоль стенок посуды. А затем аспирируйте PBS. Чтобы подготовиться к окрашиванию DAPI, добавьте пять микролитров реагента для окрашивания DAPI на предметное стекло.

Затем снимите крышку листка с посуды с помощью скальпеля. И слейте излишки PBS на чехоле, коснувшись края чехла бумажным полотенцем. Теперь закрепите защитный лист вверх ногами на каплю окрашивающего реагента DAPI на предметное стекло так, чтобы клетки подвергались воздействию окрашивающего реагента DAPI.

Наконец, исследуйте окрашенные клетки под флуоресцентным микроскопом, оснащенным фильтром DAPI. Показана морфология ядра в каждом из трех режимов клеточной смерти. Наблюдаются апоптотические клетки с конденсированными ядрами.

Множественные доли наблюдаются в ядрах клеток, претерпевающих митотическую катастрофу. Наблюдается, что клетки, переживающие старение, демонстрируют характерные очаги гетерохроматина, связанные со старением. Показано сравнительное наблюдение ложно облученных ядер и ядер, облученных шестью серыми рентгеновскими лучами.

Кругами обозначены ядра, претерпевающие апоптоз, а стрелками — ядра, переживающие митотическую катастрофу. Показана оценка около 300 ядер, подвергшихся облучению, по сравнению с макетом. Рентгеновское облучение шести грей чаще вызывает митотическую катастрофу (около 25%), за которой следует апоптоз (около 5%) и очень редкие случаи старения.

После освоения этой техники ее можно выполнить за один час, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нельзя повредить клетки, нанося растворы непосредственно на покровные стекла. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как проточный цитометрический анализ или белки маркеров клеточной гибели, а также окрашивание бета-галактозидазы, связанное со старением, для оценки старения для более глубокого понимания каждого способа клоногенной гибели клеток.