Обнаружение редкой мутации в CtDNA с помощью следующего поколения последовательности

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы обнаружить мутации низкой частоты в циркулирующей опухоли или цДНК, чтобы предоставить клиническим врачам мощный инструмент для диагностики опухолей и мониторинга динамики опухоли в ответ на терапию. Метод тестирования цДНК может помочь ответить на ключевые вопросы о том, какие виды мутаций являются носителями пациента, такие как одиночная вариация ядерного типа, делеция вставки, вариация числа копий и структурная изменчивость. Основным преимуществом данной технологии является высокая чувствительность и специфичность, что позволяет с высокой точностью выявлять низкочастотные мутации в цДНК.

Демонстрировать процедуры будет Юлианг Янг, техник из моей лаборатории. Для начала наберите 10 миллилитров периферической крови в пробирку для сбора и осторожно переверните пробирку вверх и вниз шесть-восемь раз, чтобы перемешать содержимое. Храните образцы крови в пробирках для сбора при температуре от шести до 37 градусов Цельсия в течение 72 часов.

Центрифугируйте сборную пробирку при 1,600 г при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем с помощью пипетки для утилизации надосадочная жидкость или плазма передаются из пробирки в четыре чистые двухмиллилитровые центрифужные пробирки с соответствующей маркировкой, не повреждая гранулу. Используйте чистую пипетку для утилизации, чтобы перенести один миллилитр клеток в двухмиллилитровую центрифужную пробирку с соответствующей маркировкой.

Храните клетки при температуре минус 20 градусов Цельсия или ниже перед выделением генома или гДНК. Затем центрифугируйте плазму при 1600 умноженных на g при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем переложите плазму в чистые центрифужные пробирки, правильно помеченные как плазма, оставив на дне примерно 0,1 миллилитра остаточного объема во избежание загрязнения.

Следует избегать попадания охристой шерсти в плазму во время процесса разделения. В противном случае большие фрагменты ДНК, извлеченные из клеток, могут разбавить цДНК и повлиять на чувствительность теста. Используя имеющийся в продаже набор, выделите cfDNA из трех миллилитров собранной плазмы, следуя инструкциям производителя.

Затем также с помощью набора изолируйте гДНК из 200 микролитров лейкоцитов, следуя инструкциям производителя. Чтобы фрагментировать контрольный образец гДНК методом ультразвуковой обработки, приготовьте один микрограмм образца гДНК в 100 микролитрах буфера Tris-EDTA в чистой ультразвуковой пробирке. Установите программу ультразвуковой обработки на 30 секунд включения и 30 секунд выключения на 12 циклов, всего 12 минут.

После подтверждения того, что продукт содержит от 200 до 250 фрагментов пар оснований, перенесите все продукты фрагментации в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 150 микролитров магнитных шариков, и инкубируйте образец в течение пяти минут, чтобы выбрать правильные фрагменты. Далее поместите трубку на магнитную решетку на 30 секунд и удалите надосадочную жидкость. Затем, держа тюбик на решетке, добавьте 200 микролитров свежеприготовленного 80% этанола для мытья бусин.

Инкубируйте шарики в течение 30 секунд, прежде чем удалить надосадочную жидкость, и повторите промывку. Держите тубу на решетке с открытой крышкой, чтобы высушить бусины на воздухе. Затем элюируйте фрагменты ДНК, добавив в бусины 32 микролитра 10 миллимолярного Tris-HCL.

Чтобы провести реакцию подготовки к концу в соответствии с инструкциями производителя, в стерильную пробирку, не содержащую нуклеаз, добавьте семь микролитров реакционного буфера, три микролитра смеси ферментов, 30 нанограммов cfDNA и дважды дистиллированную воду общим объемом 60 микролитров. В отдельную пробирку добавьте те же компоненты, но с одним микрограммом гДНК вместо cfDNA. Инкубируйте смесь в термоамплификаторе при температуре 20 градусов Цельсия в течение 30 минут, а затем при температуре 65 градусов Цельсия в течение 30 минут без нагрева крышки.

Сразу после инкубации добавьте в пробирку 30 микролитров мастер-смеси для лигирования, один микролитр усилителя лигирования и четыре микролитра уникального адаптера для секвенирования. Инкубируйте реакцию в термоамплификаторе при температуре 20 градусов Цельсия в течение 15 минут без нагрева крышки. Вихревом суспендируйте магнитные бусины и оставьте бусины при комнатной температуре не менее чем на 30 минут.

Затем добавьте 87 микролитров ресуспендированных магнитных шариков в реакцию лигирования. Хорошо перемешайте, пипетируя вверх и вниз, а затем инкубируйте образец при комнатной температуре в течение пяти минут. После промывки и сушки шариков на воздухе вымывайте мишень ДНК из бусин, добавляя 20 микролитров 10 миллимоляра Tris-HCL.

Добавьте 20 микролитров адаптерных лигированных фрагментов ДНК, пять микролитров индексного праймера i7, 25 микролитров мастер-смеси библиотечной амплификации и дважды дистиллированную воду общим объемом 50 микролитров. ПЦР амплигируют адаптер лигированной кфДНК или гДНК. Затем добавьте 45 микролитров взвешенных магнитных шариков в ДНК, обогащенную ПЦР.

Перемешайте образец, пипетируя вверх и вниз, и инкубируйте его в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости и промывки шариков используйте 30 микролитров 10 миллимолярного Трис-HCL для элюирования фрагментов ДНК с помощью адаптеров. Чтобы провести целевой захват ДНК, в стерильной пробирке заблокируйте образец, добавив 1,5 микрограмма пулинговых библиотек, по восемь микролитров P5 блока 100P и P7 блока 100P, и пять микролитров по одному микрограмму на микролитр одной ДНК.

Высушите содержимое пробирки с помощью вакуумного концентратора, установленного при температуре 60 градусов Цельсия. Гибридизуйте зонды захвата ДНК с библиотекой, добавив 8,5 микролитров буфера для гибридизации 2X, 2,7 микролитра усилителя гибридизации и 1,8 микролитра дважды дистиллированной воды, не содержащей нуклеаз. Перемешайте пипеткой вверх и вниз и выдерживайте в термомиксере при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут.

Затем сразу же добавьте четыре микролитра пользовательского щупа. Инкубируйте образцы в термомиксере при температуре 65 градусов Цельсия с крышкой, нагретой до 75 градусов Цельсия, в течение четырех часов. Инкубируйте гибридизированную целевую ДНК с шариками стрептавидина, а затем промойте бусины, чтобы удалить несвязанную ДНК.

Используйте коммерческий набор в соответствии с инструкцией производителя, чтобы получить итоговые 20 микролитров ресуспендированных бусин с захваченными фрагментами ДНК. Этап промывки несвязанной ДНК из шариков стрептавидина должен быть быстрым. В противном случае эффективность захвата целевой ДНК может быть снижена.

Амплифицируйте захваченные фрагменты ДНК путем проведения ПЦР с помощью коммерческого набора с двумя микромолярными олигонуклеотидами позвоночника в соответствии с инструкцией производителя. Наконец, добавьте 45 микролитров взвешенных гранул непосредственно в продукт ПЦР и обогатите амплифицированные целевые фрагменты ДНК, связанные с гранулами, путем элюирования 30 микролитрами 10 миллимолярного трис-HCL. Количественно оцените фрагменты и проведите секвенирование и анализ данных в соответствии с текстовым протоколом.

В этой таблице показано, как ER-seq улучшает глубину покрытия на 23% по сравнению с традиционным методом. Это связано с эффективным восстановлением молекул cfDNA, что значительно улучшает анализ редких мутаций. Также очевидно, что уникальные адаптеры для секвенирования, используемые в ER-seq, позволяют легко дифференцировать естественные и индуцированные ПЦР дупликации.

Как подробно описано в этой таблице по результатам вызовов, анализ на основе ER-seq был на 100% согласован для обнаружения EGFR pL858R, а частота обнаружения была немного выше по сравнению с традиционным анализом. Важно отметить, что анализ ER-seq позволил обнаружить другие относительно низкочастотные мутации, включая EGFR pT790M, которая не была распознана традиционным анализом из-за высокого уровня фонового шума. После освоения этой техники ее можно выполнить за 48 часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что следует избегать потери очень малого количества cfDNA во время экстракции, подготовки библиотеки и промывки шариков после гибридизации. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как цДНК пациента была собрана, подготовлена и таргетирована на основе уникальной идентификации для секвенирования. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области жидкостной биопсии к изучению лучших практик принятия клинических решений.