У млекопитающих деление клеток в 3D матрицы через количественного отражения конфокальная микроскопия

Общая цель этой процедуры заключается в изучении деления клеток млекопитающих и взаимодействия клеточного матрикса в физиологически значимой 3D-среде. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает эффективный и общий подход к изучению деления клеток млекопитающих и взаимодействий клеточного матрикса. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы клеточной биологии, такие как молекулярная основа развития нормальной и патологической ткани.

За день до трансфекции поместите пять миллионов HEK-293 Т-клеток в чашку для клеточных культур объемом 100 мл в 10 мл нормальной среды для культивирования клеток. Инкубируйте эти клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом. На следующий день, непосредственно перед началом трансфекции, извлеките флакон с реагентом для трансфекции от четырех градусов Цельсия и оставьте его до комнатной температуры.

Затем для начала добавьте один миллилитр восстановленной сыворотки среды в стерильную микрофуговую пробирку. К этому добавляют заданное количество плазмид лентивирусного вектора, используемых для трансфекции, и перемешивают с помощью пипетирования. Инкубируйте трубку при комнатной температуре в течение пяти минут.

Через пять минут добавьте в эту пробирку 48 микролитров реагента для трансфекции и аккуратно перемешайте с помощью пипетирования. Впоследствии инкубируйте эту смесь при комнатной температуре не менее 15 минут. После завершения инкубации извлеките из инкубатора планшет с Т-клетками HEK-293

Добавьте приготовленную смесь реагентов для трансфекции ДНК, капните по каплям на клетки и аккуратно покрутите пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение в пластине. Поместите пластину обратно в инкубатор. Примерно через шесть часов после трансфекции извлеките пластину и аспирируйте среду.

Добавьте 10 миллилитров свежей питательной среды и перенесите тарелку обратно в инкубатор. В несколько временных точек, через 24, 48 и 72 часа после трансфекции, собирайте питательную среду, содержащую частицы лентивируса, в отдельные пробирки. Затем отфильтруйте собранную питательную среду через стерильный фильтр 0,45 микрона, чтобы удалить клеточный мусор.

Заменяйте свежей питательной средой после каждого сбора урожая. Фильтрат, содержащий частицы лентивируса, можно использовать для трансдукции сразу или хранить при температуре минус 80 градусов Цельсия. Планшет для клеток карциномы молочной железы человека MDA-MB-231 в 35-миллиметровой культуральной чашке в нормальной питательной среде.

Инкубируйте эти клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом. На следующий день отсадите питательную среду из планшета и добавьте один миллилитр частиц лентивируса вместе с одним миллилитром свежей питательной среды. Инкубируйте клетки в инкубаторе около 16 часов.

После того как инкубация с вирусными частицами будет завершена, снимите планшет для аспирации среды. Затем добавьте два миллилитра свежей среды и перенесите обратно в инкубатор на 24 – 72 часа. Проверьте экспрессию H2B-mCherry в этих трансдуцированных клетках с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.

Чтобы начать эксперименты по синхронизации, сначала на планшете MDA-MB-231 клетки экспрессируют H2B-mCherry при конфлюенции от 50 до 60% в 24-луночном планшете. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24 часов. На следующий день замените питательную среду 0,5 миллилитрами среды, содержащей два миллимоляра Тимидина.

Оставьте тарелку в инкубаторе на 24 часа. После завершения инкубации промойте клетки три раза PBS, чтобы освободить их от лечения тимидином. Затем оставляют клетки в 0,5 миллилитрах обычной питательной среды на пять часов в инкубаторе.

После этого, чтобы блокировать эти клетки в митозе, добавьте в культуральную среду Нокодазол. Оставьте клетки в инкубаторе на 12 часов. После того, как лечение нокодазолом будет завершено, выньте планшет и с помощью орбитального шейкера встряхните клетки в течение от 45 секунд до одной минуты, чтобы высвободить митотические клетки.

Затем перенесите среду, содержащую извлеченные митотические клетки, в новую центрифужную пробирку. Затем в каждую лунку добавьте по 0,5 миллилитра свежей среды. После, повторите встряхивание и извлечение клеток еще два раза.

Соберите всю собранную среду, а затем центрифугируйте ее для гранулирования митотических клеток. После отжима суспендировать клеточную гранулу в 0,25 мл свежей клеточной питательной среды. С помощью гемоцитометра подсчитайте количество клеток.

В начале этого шага приготовьте 50 миллилитров 10x раствора DMEM и простерилизуйте его фильтром. Далее определите объемы всех компонентов, которые будут использоваться для изготовления 3D коллагеновой матрицы, как указано в текстовом протоколе. Предварительно охладите все эти компоненты на льду, чтобы замедлить гелеобразование коллагена.

Теперь в предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую центрифужную пробирку добавьте необходимое количество клеток в среду, затем 10x DMEM, FBS, деионизированную воду, коллаген и, наконец, гидроксид натрия. Тщательно перемешайте с помощью пипетки объемом в один миллилитровый аппарат. Как только раствор хорошо перемешается, добавьте по 500 микролитров смеси в каждую лунку 24-луночного планшета.

Поместите планшет на 24 лунки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Через 30 минут достаньте тарелку и добавьте поверх геля 500 микролитров предварительно подогретой питательной среды. Перед проведением визуализации включите единицы живых клеток фазово-контрастного и конфокального микроскопов.

Чтобы захватить делящиеся клетки, поместите 24-луночный планшет, содержащий клетки, встроенные в коллагеновые матрицы, в живую клеточную единицу флуоресцентного микроскопа. Используя объектив 10X, найдите нижнюю часть пластины, а затем перемещайте ее вверх, пока микроскоп не сфокусируется на расстоянии около 500 микрометров от нижней части пластины. Перемещайте предметный стол, чтобы найти клетки на разных стадиях митоза и выбрать несколько положений для визуализации.

Настройте эксперимент с таймлапсом с двухминутными интервалами. Затем, чтобы получить изображение коллагеновой сети, настройте конфокальный микроскоп так, чтобы он улавливал только отраженный свет от лазера с яркостью 488 нанометров. Затем поместите пластину, содержащую клетки в коллагеновых матрицах, в живую клеточную единицу этого микроскопа.

Найдите нижнюю часть пластины и переместите линзу объектива вверх, пока она не сфокусируется на расстоянии около 100 микрометров от нижней части пластины. Перемещайте рабочую область, чтобы найти ячейки и выбрать несколько позиций для визуализации. Настройте эксперимент с таймлапсом с пятиминутными интервалами.

Здесь представлены флуоресцентные изображения делящейся клетки H2B-mCherry, экспрессирующей MDA-MB-231, встроенной в коллагеновый матрикс. Различные фазы митоза легко наблюдаются, как и ожидалось. Распределение коллагеновых волокон в белом цвете, визуализированное одновременно с помощью конфокальной отражательной микроскопии, очень мало меняется в течение митоза.

Клетка, синхронизированная фаза G2-M и встроенная в коллагеновый матрикс, завершают деление клеток в течение первых двух часов, в то время как контрольные асинхронные клетки делятся случайным образом. Количественная оценка распределения коллагеновых волокон во время интерфазной и митотической фаз позволяет предположить, что деформация матрикса минимальна при делении клеток и выше при межфазных клетках. После освоения эта техника может быть завершена за семь дней, начиная с создания стабильной клеточной линии и заканчивая анализом видеоделения клетки в 3D-матрице.

После просмотра этого видео вы, надеюсь, хорошо понимаете, как синхронизировать и контролировать деление клеток млекопитающих в 3D-матрицах с помощью визуализации живых клеток и как определить деформацию матрицы с помощью микроскопии с конфокальным отражением и методов количественного анализа изображений.