Второй гармонических поколения сигналов в кролика склеры как инструмент для оценки терапевтических ткани сшивки (TXL) для близорукости

Общая цель данного протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать использование микроскопии второго гармонического поколения для визуализации и измерения эффекта поперечного сшивания коллагена в склеральной ткани, индуцированного инъекцией субтенона агента, высвобождающего формальдегид, и подтвержденного дифференциальной сканирующей калориметрией. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области терапевтического кросслинкинга тканей, предоставляя неинвазивный метод для оценки эффектов индуцированного кросслинкинга. Основное преимущество этого метода заключается в том, что генерируемые сигналы второй гармоники очень специфичны для коллажных фибрилл, и поэтому не требуется специальной подготовки тканей, такой как окрашивание антителами.

Впервые у нас появилась идея об этом методе, когда мы прочитали о процедуре, применяемой для терапевтического кросслинкинга роговичной ткани. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку успешная микроскопия генерации второй гармоники требует тщательного размещения ткани и создания правильных условий визуализации для предотвращения повреждения тканей и артефактов при измерении сигнала. Начните лечение с инъекции субшипа в глазные яблоки кролика, как описано в текстовом протоколе.

Здесь показано схематическое изображение места инъекции субшипа. Выберите зеркало оптимального размера в соответствии с размером глаза. После трех с половиной часов инкубации втяните веки с помощью зеркала для век, чтобы оптимизировать доступ к глазному яблоку.

Отделите конъюнктиву, окружающую лимб, и разрежьте дополнительные глазные мышцы в местах их прикрепления склеры. Разрежьте верхнюю часть склеры с помощью ножниц или лезвия, чтобы создать участок один на один сантиметр с расположенным по центру местом инъекции. Соскребите оставшиеся слои сетчатки и сосудистой оболочки глаза и дважды промойте свежим PBS, каждый раз оставляя кусочки в растворе примерно на 10 секунд.

Поместите ткань в одномиллилитровые пробирки, наполненные раствором PBS, для транспортировки в центр визуализации. Чтобы максимизировать сигнал и разрешение при выполнении микроскопии ГВГ, используйте объектив, оптимизированный для пропускания инфракрасного света, и с высокой числовой апертурой. Отрегулируйте корректирующий воротник объектива в соответствии с глубиной образца.

В данном случае 0,17 миллиметра. Установите линзу с объективом 25 раз на микроскоп и нанесите большое количество иммерсионного геля на водной основе, чтобы покрыть поверхность линзы. Важно выполнить визуализацию тканей в течение 30 минут после установки образца на микроскоп, чтобы сохранить ткань увлажненной и предотвратить высыхание иммерсионного геля между объективом линзы и предметным стеклом, так как это приведет к изменениям сигнала ГВГ.

Соберите камеру ячейки, поместив 25-миллиметровую круглую крышку на нижнюю часть камеры. Положите кусочек склеровой салфетки на покровную салфетку и добавьте от 50 до 100 микролитров буфера. Накройте ткань второй круглой крышкой, наклейте и прикрутите верхнюю часть камеры, не прижимая и не расплющивая ткань.

Затем установите камеру с клеткой с образцом ткани на предметный столик микроскопа. Расположите предметный столик и отрегулируйте высоту объектива таким образом, чтобы нижняя поверхность образца была в фокусе, как это определено с помощью контроля яркого поля через окуляр. Выключите все источники света, кроме монитора компьютера, и заблокируйте как можно больше света от монитора листами алюминиевой фольги, накинутыми на предметный столик микроскопа.

В программном обеспечении отключите режим Eye Port. На панели TI Pad проверьте правильность определения объектива. На панели A1 Compact Graphical User Interface выберите инфракрасный лазер для визуализации, выберите детекторы без сканирования и выберите канал DAPI, оснащенный полосовым фильтром от 400 до 450 нанометров.

На панели A1 Multi Photon Graphical User Interface установите длину волны инфракрасного лазера на 860 нанометров и откройте затвор. Подождите, пока длина волны излучения изменится, как показывает постоянный зеленый свет. Чтобы задать условия лазерного сканирования на панели A1 Compact Graphic User Interface, выберите сканер Galvano, единичное направленное сканирование, размер кадра 1024 на 1024 пикселя, время задержки пикселей 6,2 микросекунды и усреднение линий в 2 раза.

Затем включите реальное воображение в режиме поиска и установите условия представления на панели AI Compact Graphical User Interface, регулируя мощность лазера и усиление детектора. Установите мощность лазера в диапазоне от 50 милливатт до 150 милливатт, то есть от двух до шести процентов для лазера на 860 нанометров. Выше этого диапазона может произойти повреждение тканей.

Откройте панель Таблица поиска, на которой отображается гистограмма значений интенсивности пикселей на текущем изображении, и дополнительно отрегулируйте усиление детектора на полосе с меткой высокого напряжения, чтобы максимизировать диапазон значений пикселей, избегая при этом насыщенности. Используйте образец с самым высоким сигналом SHG для поиска оптимальных настроек лазера и усиления. Поддерживайте одинаковые настройки для всех образцов, которые будут сравниваться в одном эксперименте.

Такая практика гарантирует, что ни один образец в эксперименте не насытит детектор. Чтобы отсканировать ткани в режиме предварительного просмотра, откройте инструмент обзора XYZ. Установите более низкое разрешение изображения, чтобы ускорить получение изображений в этом режиме.

На обзорной панели XYZ щелкните правой кнопкой мыши текущее положение и выберите «Сканирование пять на пять», «Три на три» или «Захват одного вида». После завершения сканирования перейдите в новое место, дважды щелкнув по области за пределами текущей предварительно просмотренной области. Включите режим Live Scan, затем сфокусируйте ткань, так как разные участки ткани могут иметь немного разные положения в осевом направлении.

Захватывайте новые поля зрения пять на пять, три на три или одиночные поля зрения. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет предварительно просмотрен большой участок ткани. В обзорном инструменте XYZ дважды щелкните место, где коллагеновые волокна видны во всем поле зрения, чтобы переместить рабочую область в это конкретное место.

Установите высокое разрешение, 1024 x 1024 пикселя и 2-кратное усреднение линий. Включите режим Live Find, отрегулируйте положение объектива так, чтобы нижняя плоскость была в фокусе, а на TI Pad с помощью дисковода Z переместите оптическую плоскость на 10 микрометров выше этого нижнего слоя. Получите изображение с помощью кнопки захвата, сохраните местоположение с помощью кнопки с плюсом в инструменте обзора XYZ.

Дважды щелкните по новому местоположению и повторите процесс настройки глубины и захвата изображения. Для каждого кусочка ткани сделайте 10 снимков. Поля обзора не должны перекрываться, как показано на сохраненных местоположениях в обзорном инструменте XYZ.

Наконец, поместите склеральные кусочки в одномиллилитровую пробирку с PBS сразу после завершения микроскопии для подготовки к последующему дифференциальному сканирующему анализу калориметрии. Для начала вырезаем центральную часть контроля и обрабатываем склеры ножницами. Высушите каждый склеральный квадрат абсорбирующей тканью и положите его на дно кастрюли DSC с помощью зубчатых щипцов.

Когда ткань находится внутри, а губа обжата и закрыта, взвесьте кастрюлю, чтобы получить влажный вес ткани. Затем поместите взвешенный образец в отведенное для него место на лотке автоподатчика DSC. Создайте метод с помощью программного обеспечения для управления приборами, указав вес ткани, и проведите термический анализ, используя периметры, перечисленные в текстовом протоколе.

После завершения анализа данных для каждого образца путем извлечения пика температуры перехода, при котором происходит термическая денатурация, с помощью программного обеспечения для визуализации прибора. Изображения склер с помощью ГВГ были проанализированы на Фиджи на предмет средней яркости пикселей. Когда изображение открыто и выбрано меню анализа, а затем измерение, открывается таблица с результатами, содержащая среднюю яркость сигнала.

Кроме того, в меню «Анализ» выбран параметр «Гистограмма» для создания гистограммы значений интенсивности пикселей, содержащей информацию о средней яркости и изменении сигнала на изображении. Это измерение было повторено для всех изображений из контрольных и сшитых образцов. Здесь демонстрируются репрезентативные ГВГ-изображения склер с сопутствующим анализом гистограммы, включая среднюю яркость.

Контрольный образец характеризуется волнистым расположением фибрилл. Здесь показан образец, сшитый с помощью 400 миллимолярного SMG с увеличенной интенсивностью пикселей, обнажая коллагеновые волокна, которые кажутся более прямыми. Результаты термического анализа показывают более высокий пик температуры денатурации и подтверждают эффект сшивки.

Показан контрольный образец и кривая денатурации сшитого образца размером 400 мкл. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как подготовить сшитый образец, и как выполнять микроскопию ГВГ на склеральных образцах. Как правило, новички в этом методе испытывают трудности с точной инъекцией в субшипное пространство, хирургическим путем извлечения квадрата вокруг места инъекции и установки условий изображения для сканирования ткани в режиме предварительного просмотра.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как аутолуоресценция, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как анализ эластина, включая количественное определение и морфологию. Применение этого метода доставки сшивающего агента распространяется на терапию миопии высокой степени и задней стафиломы, поскольку он обеспечивает более легкий доступ к заднему полюсу с целью стабилизации склеры. Применение этого метода микроскопии распространяется на диагностику миопии высокой степени и осложнений, вызванных ослаблением коллагена, путем измерения состояния коллагенового кросслинкинга в пораженной склере или путем измерения результата после завершения желаемой процедуры кросслинкинга.

Таким образом, этот метод кросслинкинга и микроскопия второго гармонического поколения могут дать представление о склеральном кросслинкинге, он также может быть применен к другим тканям, таким как роговица, кожа, хрящи, сухожилия, сердечные клапаны и кровеносные сосуды.