Метод альтернативной культуры для поддержания геномной Hypomethylation мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием MEK ингибитор PD0325901 и витамином С

Мы подробно описаны два химической основе протоколы для культивирования мышиных эмбриональных стволовых клеток. Этот новый метод использует синергетический механизмы содействия тет опосредованной окисления (витамин C) и подавления de novo синтеза 5-метилцитозин (по PD0325901) для поддержания ДНК hypomethylation и плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток мыши.

Общая цель этого протокола заключается в использовании низкомолекулярных соединений PD0325901 и витамина С для поддержания гипометилированного и плюрипотентного состояния в эмбриональных стволовых клетках мышей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области культивируемых эмбриональных стволовых клеток мыши FBS, такие как гетерогенность морфологии и дегиперметилирование. Таким образом, основное преимущество этого метода заключается в том, что эмбриональные стволовые клетки мыши способны поддерживать превосходную морфологию и гипометилированное и недифференцированное состояние.

После приготовления планшетов и буферов, согласно текстовому протоколу, предварительно разогрейте мышиные ЭС клетки, питательную среду, трипсин и ПБС на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы пройти через клетки, отсадите среду из чашки и используйте два миллилитра PBS для промывания клеток два раза. Затем снимите PBS и добавьте в клетки 0,3 миллилитра трипсона ЭДТА и быстро наклоните чашку, чтобы покрыть клетки в растворе.

Немедленно удалите трипсин и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты, чтобы отделить клетки. Добавьте два миллилитра предварительно подогретой сывороточной среды, чтобы инактивировать трипсин, и используйте пятимиллилитровую пипетку, чтобы повторно суспендировать клеточные колонии 10 раз в одноклеточную суспензию. Налейте 150 микролитров клеточного раствора в новую шестисантиметровую посуду, покрытую желатином, и добавьте три миллилитра свежеприготовленной VCPD0325901 среды.

Культивируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и пяти процентах CO2. Из-за нестабильности Vc каждые 24 часа во время инкубации удаляйте старую питательную среду и добавляйте три миллилитра свежей среды Vcpd0325901. После достижения 70-80-процентной конфлюенции пропустите клетки и продолжайте культивировать их, как показано на рисунке.

Чтобы провести экстракцию ДНК, соберите клетки с трипсином, как было показано ранее, и используйте набор для очистки геномной ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Добавьте 100 микролитров ультрачистой воды в пробирку с ДНК и растворите ДНК пипетированием примерно 15 раз. Затем с помощью спектрофотометра измерьте соотношение Od260 и 280, чтобы определить концентрацию и качество ДНК.

Концентрация ДНК должна составлять около 500 нонограмм на микролитр. Затем расщепите пять микрограммов ДНК, объединив их с пятью микролитрами 100 миллимолярного трис-гидрохлорида PH7,6, двумя единицами кишечной фосфатазы теленка, одной единицей Dnase One и 0,005 единицами змеиного яда, фосфодиэстеразой. Затем используйте ультрачистую воду, чтобы довести объем до 50 микролитров.

Инкубируйте реакцию при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующее утро соберите образец центрифугированием при температуре 1000xg при комнатной температуре в течение одной минуты. Затем перелейте раствор в ультрафильтрационные пробирки и вращайте образцы при температуре 13 000xg и 4 градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы удалить ферменты пищеварения.

Чтобы подготовить образцы к анализу 5HMC, перенесите 36 микролитров фильтрата в новую пробирку объемом один миллилитр и добавьте четыре микролитра D35HMC для окончательной концентрации в три наномоляра. Для анализа 5MC пипетируйте 196 микролитров ультрачистой воды в новую центрифужную пробирку и добавьте четыре микролитра фильтрата из-за высокой плотности 5MC в геномной ДНК. Перелейте 36 микролитров разбавленного раствора 5MC в новую центрифужную пробирку и добавьте четыре микролитра D35MC для получения конечной концентрации 50 наномоляров.

Используйте D35HMC и D35MC в качестве внутренних стандартов для калибровки 5HMC и 5MC соответственно. После настройки параметров для анализа 5MC и 5HMC в программном обеспечении UHPLCMS, согласно текстовому протоколу, установите параметры для QQQMSMS, нажав MS QQQ. Для параметра «Время остановки» выберите «Без ограничений/как насос».

В качестве источника ионов выберите ESI. Для фильтрации по времени установите флажок Ширина пика и введите 0,07 минуты. Чтобы настроить временные сегменты, в качестве времени начала выберите ноль.

Чтобы задать режим сканирования в MRM для анализа намека из столбца, в поле Тип сканирования выберите MRM. В поле Значение деления выберите To MS. Для Delta EMV plus введите 200, а для Delta EMV минус введите ноль. Постройте параметры для мониторинга переходов, сначала щелкнув MSQQQ one acquisition.

Чтобы задать сегменты сканирования, в поле Задержка введите 90. Чтобы задать напряжения фрагментов для фрагментора, введите 90. Для Collision Energy введите пять.

В поле Cell Accelerator Voltage введите четыре. Чтобы установить режим положительных ионов, для параметра Полярность выберите положительный. Для проведения СВЭЖХ-разделения мононуклеозидов готовят растворы а и б для аллюзии 5МК и цитозина путем смешивания 500 миллилитров ультрачистой воды с 500 микролитрами муравьиной кислоты для раствора а.

Затем отмерьте 500 миллилитров 100-процентного метанола и раствор b. Смешайте раствор a и раствор b в соотношении объема 95 к 5 объему в качестве подвижной фазы для элюирования 5MC и C. Затем установите скорость потока на 0,25 миллилитров в минуту. Отделите 5HMC с помощью оптимизированной градиентной аллюзии.

Затем установите скорость потока на уровне 0,25 миллилитра в минуту. Мониторинг переходов для 5MC, D35MC, DC, 5HMC и D35HMC. Установите напряжение капилляров на 3 500 вольт.

Затем установите объем инъекции в 5 микролитров и проанализируйте каждый образец по три раза. Используйте соответствующие стандартные кривые для оценки количества 5MC и 5HMC в соответствии с текстовым протоколом. Как видно из этого анализа геномной ДНК в клетках ES мышей с помощью СВЭЖХ МСМС, лечение VcPD0325901 привело к более быстрому снижению метилирования ДНК и достигло стабильных пяти уровней MC через пять дней, в то время как лечение Vc 2i привело к сопоставимому уровню на 11-й день.

Этот график показывает, что Vc-содержащая обработка резко увеличивала частоту 5HMC через один день, а после этого уровни 5HMC постепенно снижались из-за прогрессирующего снижения субстрата 5MC. Вестерн-блоттинг показал, что Prdm14 был значительно повышен, в то время как Dnmt3b и его кофактор, Dnmt3l, значительно снижались при отступлении клеток с PD0325901, что указывает на действие PD0325901 в стирании 5MC. В этом анализе щелочной фосфатазы все мышиные ЭС-клетки были окрашены в фиолетовый цвет с шарообразной морфологией при культивировании в течение 26 дней в VcPD032590, что указывает на недифференцированное состояние.

Напротив, клетки, выращенные в FBS, содержащем только среду, имели светлый цвет с частичным расширением, указывающим на частичную дифференцировку. После освоения этой техники ее можно выполнить за пять часов, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что FBS необходимо предварительно проверить.

Кроме того, следует избегать чрезмерного дозирования клеток через проход и ежедневной замены питательной среды VcPDO325901. После этой разработки этот метод открывает путь для исследователей в области культивирования мышиных ЭС-клеток in vitro для изучения развития и процессов эмбрионов in vitro и сгенерированных клеток, имеющих медицинское значение для регенеративной медицины. После просмотра этого видео у вас должно сложиться более глубокое понимание того, как поддерживать морфологию роста и гиперметилированное и множественное потенцирующее состояние для мышиных ЭС-клеток с помощью двух малых молекулярных компонентов, ингибитора MEK, PD0325901.

Не забывайте, что работа с Trisol, DMS или PMS и DTT может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток, маски и очков.