Процесс, основанный на сочетании изотопный Tracer экспериментов расследовать микробного метаболизма множественные источники питательных веществ

Общая цель этой процедуры заключается в количественном исследовании метаболизма нескольких источников питательных веществ с использованием меченых субстратов. Этот рабочий процесс позволяет определить судьбу потребляемых питательных веществ и метаболическое происхождение соединений, синтезируемых дрожжами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробного метаболизма, например, как весь метаболизм работает в зависимости от условий окружающей среды.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет выяснить и количественно определить распределение белка питательных веществ из нескольких источников. Этот метод был использован для исследования азотистого метаболизма дрожжей, но он также может быть применен к другим метаболизмам и микроорганизмам. Ключ к успеху в этом эксперименте лежит в воспроизводимости ферментации.

Пользователи должны уделять особое внимание сбору клеток на одной и той же определенной физиологической стадии. Демонстрировать процедуру будут Кристиан Пику из нашего технического персонала, Полин Сегино, аспирант лаборатории, и Стефани Роллеро, научный сотрудник. В автоклаве пастеризуйте каждую синтетическую среду, подготовленную для каждого источника азота, в литровой колбе с магнитной мешалкой.

Растворите соответствующее количество меченой молекулы для достижения желаемой конечной концентрации в среде. Простерилизуйте среду с помощью одноразовой системы вакуумной фильтрации. С помощью стерильного мерного цилиндра разделите среду между двумя предварительно стерилизованными ферментерами, которые содержат магнитную мешалку и оснащены ферментационными замками, чтобы избежать попадания кислорода, но обеспечить выделение углекислого газа.

После выращивания штамма cerevisiae в среде YPD соберите предкультуральную аликвоту под ламинарным потоком и количественно оцените популяцию клеток с помощью электронного счетчика частиц с апертурой 100 микрометров. После центрифугирования предварительной культуры гранулу суспензируют в соответствующем объеме стерильной воды для получения конечной концентрации от 2,5 до 10 до 9-х клеток на миллилитр. Затем инокулируйте каждый ферментер одним миллилитром клеточной суспензии.

После этого подготовьте платформу для брожения, установив ферментеры в опорные направляющие, которые правильно расположены на 21-позиционных перемешивающих пластинах, и установите скорость перемешивания на уровне 270 об/мин. Чтобы начать онлайн-мониторинг каждой ферментации, запустите приложение для управления роботом, нажмите кнопку «Начать анализ» и выберите объем ферментации, который будет проводиться. Чтобы убедиться, что отображаемый интерфейс позволяет отображать количество и положение ферментеров на платформе, щелкните правой кнопкой мыши по местоположению слота и выберите «Отключить», чтобы отключить мониторинг пустых позиций.

Чтобы инициализировать программное обеспечение для расчетов, нажмите кнопку «Инициализатор» и подтвердите нажатием кнопки OK. Затем нажмите кнопку «Пуск» в приложении для управления роботом, чтобы начать сбор веса. Затем центрифугируйте два шестимиллилитровых образца, взятых из ферментеров при температуре 2000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Когда закончите, переложите каждую замороженную надосадочную жидкость в две пробирки и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Промойте каждую гранулу дважды пятью миллилитрами дистиллированной воды и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия для измерения изотопного обогащения. Добавьте 200 микролитров 25% раствора сульфосалициловой кислоты, содержащего 2,5 миллимоляра норлейцина в качестве внутреннего стандарта, к 800 микролитрам образца для удаления молекул с высокой молекулярной массой. После инкубации и центрифугирования отфильтруйте смесь через нитроцеллюлозную мембрану размером 0,22 микрометра и поместите образец в систему анализа аминокислот.

В программе или программном обеспечении системы анализа нажмите на кнопку «Запустить», чтобы начать анализ жидкостной хроматографии с анализатором, оснащенным катионообменной колонкой. Далее приготовьте окисленный экстракт, суспензировав заранее подготовленную меченую клеточную гранулу в 200 микролитрах перформативной кислоты. После инкубации в течение четырех часов при четырех градусах Цельсия остановите реакцию, добавив 33,6 миллиграмма сульфата натрия.

Добавьте 800 микролитров шести обычных соляных кислот к окисляемому экстракту и инкубируйте образец в герметично закрытой стеклянной пробирке в течение 16 часов при температуре 110 градусов Цельсия в духовке с сухим жаром. Дав образцу остыть до комнатной температуры, добавьте 200 микролитров 2,5 миллимолярного нейролейцина и удалите газообразный хлористый водород струей азота. Высушенный экстракт дважды промыть 800 микролитрами дистиллированной воды, а затем 800 микролитрами этанола.

Затем добавьте в экстракт 800 микролитров 200-миллимолярного буфера из ацетата лития. Определить относительные концентрации аминокислот в белках в образце с помощью хроматографического метода, описанного ранее. Гидролизуйте меченую клеточную гранулу, добавив 1,2 миллилитра шестимолярной соляной кислоты и инкубируя образец в течение 16 часов при температуре 105 градусов Цельсия в плотно закрытой стеклянной трубке в духовке с сухим жаром.

Дав образцу остыть до комнатной температуры, добавьте 1,2 миллилитра дистиллированной воды. После центрифугирования для удаления клеточного мусора распределите надосадочную жидкость на шесть фракций по 400 микролитров в открытых стеклянных пробирках. Сушите фракции в духовке с сухим жаром при температуре 105 градусов Цельсия в течение четырех-пяти часов, пока они не достигнут консистенции сиропа.

Во время гидролиза биомассы высушите фракцию до консистенции сиропа, часто контролируя кислотность работы. Для дериватизации ECF охлажденный высушенный гидролизат растворить в 200 микролитрах 20-миллимолярной соляной кислоты и 133 микролитрах смеси пиридина и этанола в соотношении один к четырем. Добавьте 50 микролитров этилхлорформиата для дериватизации аминокислот.

После того, как углекислый газ будет высвобожден, переложите смесь в центрифужные пробирки, которые содержат 500 микролитров дихлорметана, чтобы извлечь дериватизированные соединения. Переведите образцы на вихрь в течение 10 секунд. После центрифугирования в течение четырех минут при 10 000 перегрузках соберите нижнюю органическую фазу каждого образца с помощью пипетки Пастера и перенесите в флакон автосамплера GC, который содержит вставку из конического стекла, чтобы каждый образец мог быть непосредственно введен в прибор GCMS.

Для проведения процедуры ECF используются реагенты дериватизации ВЭЖХ. Часто меняйте реагенты ECF. Для дериватизации ДМФ-ДМА высушенный гидролизат растворить в 50 микролитрах метанола и 200 микролитрах ацетонитрила.

Добавьте 300 микролитров DMF-DMA и перемешайте образец. Затем перенесите образец во флакон автосамплера GC, который содержит вставку из конического стекла. Для дериватизации BSTFA суспендируйте гидролизат в 200 микролитрах ацетонитрила.

Добавьте в образец 200 микролитров BSTFA и герметично закройте стеклянную трубку. После инкубации в течение четырех часов при температуре 135 градусов Цельсия перелейте охлажденный экстракт непосредственно в флакон автосамплера GC, который содержит вставку из конического стекла. Теперь проанализируйте образцы с помощью газового хроматографа, оснащенного инжектором автосамплера и соединенного с масс-спектрометром.

Нажмите на «Инструмент» в меню компьютерной программы. На вкладке Последовательность щелкните таблицу Edit Sample Log Table, чтобы создать список примеров, и нажмите кнопку Run and Run Sequence, чтобы начать инъекции. После завершения анализа запишите кластер интенсивностей для каждой аминокислоты, который соответствует ее различным массовым изотопомерам.

Добавьте 10 микролитров соответствующей дейтерированной внутренней нормы в пять миллилитров надосадочной жидкости в стеклянной трубке объемом 15 миллилитров. Добавьте один миллилитр дихлорметана, плотно закройте пробирку и встряхните образец на качающейся платформе в течение 20 минут. После центрифугирования соберите нижнюю органическую фазу в 15-миллилитровую стеклянную пробирку.

После повторения экстракции дихлорметаном высушите органический экстракт до 500 миллиграммов безводного сульфата натрия и соберите жидкую фазу с помощью пастеровской пипетки. Сконцентрируйте экстракт в четыре раза под азотным флюсом. Затем перенесите концентрированный образец во флакон с автоподатчиком GC.

Для количественного определения GCMS введите два микролитра образца с коэффициентом разделения 10 к одному и отделите извлеченные летучие молекулы с использованием соответствующего температурного профиля печи. С помощью электронных таблиц в текстовый протокол введите исходные значения данных, которые соответствуют концентрации внеклеточных аминокислот, сухой массе клеток, содержанию белка в клетках, концентрации летучих молекул и изотопному обогащению протеиногенных аминокислот и летучих молекул. Здесь показана принципиальная схема рабочего процесса по исследованию управления дрожжами многочисленными источниками азота, которые обнаруживаются во время брожения вина.

Для различных точек отбора проб биологические параметры демонстрируют высокую воспроизводимость среди фермен. Здесь представлен обзор перераспределения азота из источников в виноградном соке на все протеиногенные аминокислоты. В сочетании с определением массового баланса, измерение изотопного обогащения протеиногенных аминокислот обеспечило первую количественную оценку вклада аргинина, глутамина, аммония и других источников азота в аминные группы каждого из этих соединений.

Здесь показано сравнение количества потребляемой аминокислоты, которая непосредственно восстанавливается в биомассе. Показано распределение потребляемых алифатических аминокислот, лейцина и валина в метаболической сети дрожжей. Более 96% потребляемого валина и лейцина восстанавливается в продуктах их переработки.

Удивительно, но значительная часть валина и лейцина катаболизируется, несмотря на значительный дисбаланс между наличием этих соединений в среде и их содержанием в биомассе. После освоения этой техники ее можно сделать за пять дней. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о тщательном выборе маркировочной части субстрата в соответствии с научными данными.

Чтобы обеспечить хорошую биологическую воспроизводимость, проводите ферментацию и хроматографический анализ в двух экземплярах. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области микробиологии к изучению того, как метаболизм и физиология микроорганизмов изменяются в зависимости от условий окружающей среды. Не забывайте, что работа с дериватизационными реагентами и растворителем аргинина может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и работа под вытяжным шкафом.