Целевые ячейки предварительного обогащения и весь геном усилители на одну ячейку вниз по течению характеристика

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать клетки от клеточной суспензии, чтобы сделать их доступными для последующего анализа отдельных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в контексте жидкостной биопсии и клеточной гетерогенности. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет выделять одиночные клетки на основе антител и восстанавливать их для последующего молекулярно-генетического анализа на уровне отдельных клеток.

После того, как этот метод будет разрешен для использования у пациентов, он позволит охарактеризовать циркулирующие опухолевые клетки раковых больных. Поскольку этот метод может дать представление о гетерогенности между отдельными клетками, он может быть применен ко всем видам клеточных суспензий, содержащих субпопуляции, такие как образцы крови, образцы из клеточных культур или разрозненные ткани и органы. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы использовали устройство для обогащения in vivo, не способное высвобождать клетки для последующего анализа.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы забора одиночных клеток с помощью лазерной микродиссекции или микроманипуляций трудно выполнить, поскольку процесс сбора одиночных клеток подвержен потере клеток и требует высокого уровня знаний. В одном миллилитре предварительно подогретой среды для культивирования клеток ресуспендируйте клетки, меченные HT-29 CFSE, и дайте им регенерировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Чтобы собрать клетки, центрифугируйте при 300 г в течение трех минут.

Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре готового к использованию раствора для окрашивания ДНК Hoechst 33342 при температуре 37 градусов Цельсия на 10 минут. Далее центрифугируйте клеточную суспензию при 300 г в течение трех минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в четырех миллилитрах 1X фосфатно-солевого буфера.

Затем подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и проверьте флуоресцентное мечение с помощью флуоресцентного микроскопа. Затем центрифугируйте клетки при 300 г в течение трех минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в концентрации примерно 500 000 клеток на миллилитр и поместите клетки на лед. В пять миллилитров периферической крови добавьте от 500 до 500 000 клеток, а затем перемешайте, перевернув трубку.

После извлечения провода из отсека для хранения снимите резиновый колпачок, который удерживает провод, промойте провод в 1X фосфатно-солевом буфере и установите его в колпачок трубки. Затем инкубируйте трубку на наклонном роликовом миксере со скоростью пять оборотов в минуту в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации трижды промойте проволоку в 1X фосфатно-солевом буфере.

Затем храните проволоку в 15-миллилитровой пробирке, содержащей 1X фосфатно-солевой буфер, в темноте. Нарисуйте прямоугольную область на предметном стекле с помощью жирной ручки, затем добавьте на нее 500 микролитров 1X фосфатно-солевого буфера. Чтобы погрузить функциональную часть проволоки в 1Х фосфатно-солевой буфер, согните нефункциональную часть проволоки и поместите ее на предметное стекло.

Чтобы подсчитать количество захваченных ячеек, визуально осмотрите обе стороны провода. После осмотра перенесите проволоку обратно в 15-миллилитровую трубку с 1X фосфатно-солевой буфером и держите в темноте. В одном миллилитре 1Х фосфатно-солевого буфера растворите четыре миллиграмма разделительного буферного компонента, затем отфильтруйте раствор через стерильный фильтр толщиной 0,2 микрометра, чтобы получить готовый к использованию буфер.

Затем нагрейте высвобождающий буфер до 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После нагревания перенесите 1,6 миллилитров разделительного буфера, чтобы полностью заполнить реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Далее инкубируйте функциональную часть проволоки в высвобождающем буфере при температуре 37 градусов Цельсия на водяной бане в течение 20 минут.

После инкубации поместите проволоку на шейкер со скоростью 500 оборотов в минуту на 15 минут. Затем центрифугируйте проволоку при 300 г в течение 10 минут. После окончания центрифугирования вытесните проволоку из пробирки, закройте крышку и снова центрифугируйте пробирку при 300 г в течение 10 минут.

Чтобы уменьшить объем клеточной суспензии, следует отбросить все, кроме 100 микролитров надосадочной жидкости для микроманипуляций или 300 микролитров для последующего цитоцентрифугирования и лазерной микродиссекции. Затем быстро приступайте к отбору проб одиночных клеток. Для проведения микроманипуляции перенесите все 100 микролитров клеточной суспензии на предметное стекло.

Затем поместите предметное стекло на микроскоп, оснащенный микроманипулятором, и дайте клеткам отстояться в течение пяти минут. Затем в 0,2-миллилитровые ПЦР-пробирки пипеткой пипеткой два микролитра лизиса клеток мастера смешать и перенести на лед. С помощью микроманипулятора соберите одну клетку в одном микролитре 1X фосфатно-солевого буфера.

Затем перенесите клетку непосредственно в два микролитра мастер-смеси для лизиса клеток. Используйте настольную микрофугу, чтобы быстро раскрутить образцы до 2000 г в течение трех секунд, чтобы собрать жидкость на дне пробирки. Затем перенесите образец на лед и приступайте к амплификации всего генома на основе адаптера-линкера.

Аспирируйте только одну клетку, используя максимум один микролитр буфера. При переносе клетки в раствор для лизиса убедитесь, что вы видите пузырьки, возникающие из раствора, указывающие на то, что весь аспирированный объем был перенесен. Для лазерной микродиссекции цитоцентрифугируйте все 300 микролитров клеточной суспензии на предметное стекло с мембранным покрытием в дозе 300 г в течение пяти минут.

Затем поместите предметное стекло с мембранным покрытием на микроскоп, способный проводить лазерную микродиссекцию. Далее пипеткой внесите 4,5 микролитра мастер-смеси для лизиса клеток в колпачок 0,2-миллилитровой ПЦР-пробирки. Поместите колпачок над образцом и соберите одну клетку с помощью лазерной микродиссекции.

Сразу после этого проверьте наличие изолированных клеток в колпачке для ПЦР, извлеките пробирку для ПЦР из микроскопа для лазерной микродиссекции и закройте пробирку. Соберите всю жидкость на дно трубки с помощью короткого отжима. Перенесите образец на лед и приступайте к амплификации всего генома на основе адаптера-линкера.

Убедитесь, что вы восстановили лазерную микродиссектированную клетку. Поэтому важно покрыть раствором лизиса всю крышку пробирки. После микродиссекции проверьте крышку пробирки на наличие клетки.

Чтобы показать клетки, окрашенные CFSE и Hoechst 33342, иммунофлуоресцентная визуализация была проведена до зарядки провода, во время прикрепления клеток к проводу, затем отсоединения от провода и, наконец, на предметном стекле. Иммунофлуоресцентные изображения клеток до зарядки показывают яркое нуклеиновое окрашивание синего цвета, в то время как цитоплазма клеток показывает зеленое окрашивание CFSE с гетерогенной межклеточной интенсивностью. Подобная картина окрашивания наблюдается и для ячеек, которые прикрепляются и впоследствии отсоединяются от провода.

Для проверки качества продуктов амплификации всего генома был запущен 1%-ный агарозный гель. Агарозный гель показывает мазок ДНК в диапазоне от 0,2 до более 1 килооснования для продуктов ПЦР полногеномной амплификации. Продукты ПЦР с контролем качества 4plex, полученные из одной клетки, дают продукты со 100, 200, 300 и 400 парами оснований.

Продукты, которые показывают менее трех полос, исключаются из дальнейшего анализа. После освоения этот метод позволяет изолировать отдельные клетки от клеточных суспензий за четыре часа, если он выполнен правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что клетки должны быть погружены в буфер, особенно в то время, когда они прикреплены к проводу, чтобы не повредить клетки.

После этой процедуры могут быть выполнены такие методы анализа, как сравнительная геномная гибридизация, секвенирование нового поколения и мишень-специфическая ПЦР для характеристики отдельных клеток на основе вариаций числа копий и мутаций. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделять и восстанавливать клетки из клеточных суспензий с помощью функционализированной проволоки и как брать образцы отдельных клеток для множественного молекулярно-генетического анализа. Не забывайте, что работа с человеческой кровью сопряжена с возможностью инфицирования, поэтому ношение перчаток и лабораторного халата при выполнении этой процедуры является обязательным.