Обобщённые индуцируемый экран для повторной активации MeCP2 на неактивных Х-хромосома

Начните эту процедуру с препарирования мышиных сухожильных фибробластов, как описано в текстовом протоколе. Соберите клетки с 10-сантиметровой пластины, предварительно отсасывая среду. Затем добавьте один миллилитр 0,05% трипсина ЭДТА и инкубируйте в течение двух-пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия.

После инкубации погасите трипсин девятью миллилитрами DMEM-10 и соберите ресуспендированные клетки в 15-миллилитровую коническую пробирку. Разбавьте клетки DMEM-10 до конечной концентрации одна клетка на 100 микролитров. Затем переложите клетки на 96 луночных планшетов, пипетируя по 100 микролитров суспензии в каждую лунку.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока лунки не слиются, что может занять до двух-трех недель. Заменяйте носитель на свежий DMEM-10 каждые три-пять дней. После слияния мобилизуйте клетки с 20 микролитрами 0,05% трипсина ЭДТА на лунку и разделите их на два дубликата наборов по 96 луночных планшетов.

Анализ на активность люциферазы в одном наборе планшетов. Используйте однородный анализ люциферазы Firefly, который не требует удаления среды, в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору для анализа люциферазы. Используйте результаты анализа для выбора клонов без обнаруживаемой активности люциферазы из оставшегося набора планшетов.

Разверните эти клоны сначала до 24-луночной пластины, а затем до шестилуночной пластины. Проделайте то же самое для клона с самой высокой активностью люциферазы. Это будет использоваться в качестве положительного контроля для целей валидации.

После расширения в шестилуночной пластине соберите аликвоту из каждой лунки для вестерн-блота. Мобилизуйте клетки с помощью 200 микролитров 0,05% трипсина ЭДТА. Инкубируйте клетки в течение двух-пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Охладите клетки двумя миллилитрами DMEM-10, а половину клеток переложите в другую шестилуночную пластину. Подождите, пока ячейки прикрепятся к нижней части пластины. Затем промойте клетки один раз PBS перед лизисом для вестерн-блоттинга.

Пластину с несколькими отрицательными клонами по 0,2 миллиона клеток на лунку в шестилуночной пластине. Обработайте клетки однократно 10 микромолярами 5-азацитидина. Затем инкубировать в течение 72 часов без смены среды перед анализом на активность люциферазы, как и раньше.

Затем выберите для экрана один негативный клон, который получил активность люциферазы с 5-азацитидином, и начните расширять его на несколько 10-сантиметровых пластин. Оставшиеся отрицательные клоны заморозьте в жидком азоте в качестве резервного. Положительный клон может быть сохранен в культуре тканей или заморожен до дальнейшего использования.

Утром поместите миллион неактивных X-клеток на 10-сантиметровые планшеты для культуры тканей. Во второй половине дня заинфицируйте пластины, заменив среду свежим DMEM-10, содержащим заранее определенное количество вирусного надосадочной жидкости и от пяти до 10 микрограммов на миллилитр полибрена. Через 18-24 часа отасадите среду и добавьте по 10 миллилитров свежего DMEM-10 в каждую тарелку.

Культивировать планшеты еще 48 часов. Утром мобилизуйте клетки, используя один миллилитр 0,05% трипсина ЭДТА на пластину, и погасите клетки 9 миллилитрами DMEM-10 на пластину. Пропустите суспензию через сетчатый фильтр толщиной 100 микрон.

Соберите отфильтрованные суспензии вместе и засейте два набора 10-сантиметровых пластин по одному миллиону клеток на пластине. Во второй половине дня замените среду в одном наборе пластин на DMEM-10, содержащую 15 микрограммов на миллилитр гигромицина B.In другом наборе, замените среду только свежей DMEM-10. Через 48 часов мобилизуйте клетки из гигромицина В необработанных планшетов с использованием одного миллилитра 0,05% трипсина ЭДТА.

Выдерживайте от двух до пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Далее погасите клетки 9 миллилитрами ДМЭМ-10. Возьмите отдельные образцы и немедленно приступайте к извлечению ДНК.

Продолжайте культивирование селекционного набора Гигромицин В еще шесть дней, пополняя селекционную среду свежим DMEM-10, содержащим Гигромицин В, через день. На шестой день замените выбранный носитель только на свежий DMEM-10. Подождите четыре дня для восстановления, а затем соберите образец ДНК после отбора, как и раньше.

Приступайте к выявлению шпилек, обогащенных в образцах после отбора, как описано в текстовом протоколе. Чтобы проверить попадания, сначала засейте восемь миллионов 293-футовых ячеек на каждой пластине на 10-сантиметровых пластинах. На следующий день замените среду девятью миллилитрами DMEM-10 без антибиотиков на пластину за 30 минут до пересечения.

Далее добавьте 0,5 миллилитра трансфекционной смеси по одному на каждую аликвоту трансфекционной смеси две, и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Затем выдерживают смесь при комнатной температуре в течение 20 минут. Нанесите смесь на каждую тарелку по каплям и аккуратно перемешайте пластину, чтобы перемешать.

На следующий день замените среду пятью миллилитрами свежего DMEM-10 через 10,48 часа после первоначальной трансфекции, соберите лентивирусную надосадочную жидкость и пропустите ее через фильтр толщиной 0,22 микрона, предварительно увлажненный DMEM-10 для максимального восстановления. На следующее утро поместите 0,1 миллиона неактивных X-клеток на лунку на шесть луночных планшетов. Во второй половине дня инфицируйте планшеты, заменив среду двумя миллилитрами свежего DMEM-10, содержащего лентивирусный надосадочный материал, и пятью-10 микрограммами на миллилитр полибрена.

Инфицируйте контрольную лунку вирусным надосадочным веществом, полученным из пустого лентивирусного вектора. На следующий день замените среду двумя миллилитрами DMEM-10, содержащими один миллиграмм на миллилитр пуромицина. Используйте выбор в течение четырех дней.

Через четыре дня замените среду двумя миллилитрами свежего DMEM-10 и дайте от 48 до 72 часов для восстановления. После мобилизации клеток 150 микролитрами 0,05% трипсина ЭДТА, инкубируйте их в течение двух-пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Охладите ячейки 1,5 миллилитрами DMEM-10 перед переносом в конические пробирки и центрифугированием ячеек при комнатной температуре при 500-кратном перегрузке в течение 10 минут.

Удалите среду и ресуспендируйте клетки в 100 микролитрах буфера для лизиса, предоставленного в наборе для анализа люциферазы. Выдерживайте суспензию при комнатной температуре в течение пяти минут. Через пять минут переложите суспензию в белую 96-луночную пластину.

Проведите анализ в фотолаборатории, следуя протоколу, входящему в комплект. Используйте активные Х-клетки в качестве положительного контроля и отрицательные Х-клетки, инфицированные пустым лентивирусным вектором, в качестве отрицательного контроля. Иммортализированные клоны фибробластов сухожилий мышей демонстрируют либо положительную, либо отрицательную активность люциферазы светлячков, что согласуется с размещением репортера на активной или неактивной Х-хромосоме соответственно.

Экспрессия MeCP2, определяемая по вестерн-блоттингу, демонстрирует обратную картину. Следует отметить, что активность люциферазы светлячков может быть индуцирована в отрицательных клонах при введении 5-азацитидина. Если ген устойчивости к гигромицину присутствует на активной Х-хромосоме, он дает преимущество в выживаемости при отборе на гигромицин по сравнению с клетками с геном на неактивной Х-хромосоме.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как спроектировать и выполнить скрининг регуляторов инактивации Х-хромосомы с помощью репортеров, селективно вставленных в неактивную Х-хромосому. Моя лаборатория ранее проводила скрининг оснований для регуляторов хроматина в дрожжах, и наш успех с этим подходом вдохновил меня на разработку этого скрининга для регуляторов инактивации X-хромосомы в клетках млекопитающих. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как использование малых, интерферирующих РНК, CRISPR, МАЛЫХ молекул, чтобы помочь ответить на дополнительные вопросы, касающиеся инактивации Х-хромосомы в клетках млекопитающих.