Изображения в реальном времени GLUT4 белка оборота первичной нейронов гипоталамуса мыши с помощью микроскопии деконволюция
7 декабря 2017 г.
Этот протокол описывает метод для наблюдения в реальном времени зеленый флуоресценции белков (ГПУП) меткой 4 транспортера глюкозы (GLUT4) белки людьми после стимуляции инсулина и характеристика биологической роли CCR5 в инсулин GLUT4 сигнальный путь с деконволюция микроскопии.
Общая цель этого эксперимента заключается в наблюдении за перемещением белка в первичных нейрональных клетках, таких как GLUT4, в нейронах гипоталамуса в режиме реального времени с минимальными повреждениями. Этот метод может объяснить ключевые вопросы, связанные с нейрональной регуляцией передачи сигналов инсулина и метаболизма, например, в случае сахарного диабета 2 типа. Основное преимущество этой методики заключается в том, что исследователи могут выделять первичные клеточные культуры и наблюдать за эффектом, индуцированным лекарством, в режиме реального времени.
Смысл этой методики заключается в выборе терапии диабета 2 типа или инсулинорезистентности, связанной с мозгом, потому что теперь мы знаем, как этот сигнал инсулина изменяется хемокином CCL5 в нейронах гипоталамуса. Для начала этой процедуры покройте посуду для культуры поли-D лизином за сутки до посева. Для чашки на шесть лунок добавьте 1,5 мл поли-D лизина в концентрации 0,05 мг/мл в каждую лунку.
На следующий день удалите поли-D лизин и дважды вымойте посуду с 2 мл ddH2O. Затем наполните 10-сантиметровые чашки Петри 20 мл моющего средства и держите их на льду. Наполните пробирки объемом 15 мл промывочной средой и держите их на льду.
Для выделения тканей мозга простерилизуйте платформу, препарирующий микроскоп и хирургические инструменты с 75% этанолом, чтобы избежать загрязнения. После этого разрежьте вокруг области пуповины, чтобы изолировать щенков, не повредив их. Затем снимите голову каждого щенка и закрепите ее на месте с помощью прямых щипцов с тонким наконечником.
С помощью других изогнутых щипцов с тонким концом удалите внешнюю кожу и череп с обеих сторон и отклейте их от переднего к тыльному направлению. Затем храните изолированные мозги в чистой чашке Петри с ледяным средством для промывки. Переверните мозг и держите брюшную сторону вверх.
Впоследствии изолируют ткань гипоталамуса с помощью изогнутых щипцов с тонким концом. Удерживайте обонятельную долю острыми щипцами и отклейте тонкие мозговые оболочки, окружающие весь мозг, изогнутыми щипцами. Перевернитесь к нижней части коры головного мозга и отделите гиппокамп от коры, потянув его в сторону.
Когда все области мозга будут изолированы, измельчите эти ткани в пробирках объемом 15 мл, содержащих ледяную среду для умывания. При этой процедуре промойте ткани, перевернув содержащую ткань трубку два-три раза. Затем держите трубку прямо, чтобы салфетки успокоились.
Удалите верхнюю среду с помощью стеклянной пипетки Пастера, прикрепленной к вакуумной системе. Чтобы промыть салфетку, добавьте 15 мл ледяного средства для умывания и переверните трубку два-три раза. После окончательного промывки удалите промывочную среду с помощью пипетки объемом 1 мл.
Инкубируйте ткани с буфером для переваривания папаин-трипсина на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 7-14 минут. После этого нейтрализуйте активность ферментов, добавив один объем фетальной бычьей сыворотки. Держите трубку на решетке и подождите одну-две минуты, чтобы салфетки осядли.
После этого осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 мл. Добавьте в пробирку 6 мл металлической среды и аккуратно проведите пипеткой вверх и вниз 50 мл пипеткой объемом 5 мл. Держите трубку на решетке и подождите одну-две минуты, чтобы толстые, недиссоциированные ткани осядли.
Далее перенесите верхнюю фазу, содержащую диссоциированные клетки, в новую пробирку и разбавьте ее гальванической средой. Затем добавьте 2 мл полной питательной среды в каждую лунку шестилуночной чашки. Чтобы подготовить клетки к визуализации в реальном времени, осторожно снимите покровные стекла с нейронами с помощью щипцов и с осторожностью поместите их на предметное стекло.
Затем удалите излишки среды с помощью деликатных рабочих салфеток, сложив их вдвое и осторожно положив на чехол, не перемещая его. Важно удалить излишки среды, чтобы предотвратить ненужное движение на чехле крышки. Затем обработайте выбранные образцы клеток CCL5 в дозе 10 нг/мл или инсулином в дозе 10 ЕД/мл в течение одной минуты.
Вслед за этим добавьте 1,5 мкл разведенного инсулина на край покровных стеблей. Затем добавьте иммерсионное масло на объектив с 60-кратным увеличением 1,52 NA. После этого поместите защитные стекла на предметный столик деконволюционного микроскопа крышкой вниз и надежно закрепите.
Используйте яркое поле или флуоресцентное освещение для идентификации целевых клеток. После этого отрегулируйте фокус до тех пор, пока целевые клетки не станут четко видны. Не перемещайте линзу объектива за пределы области скольжения крышки, чтобы избежать ненужных царапин.
Далее определите GFP-GLUT4 по сигналу GFP. Затем определите нужные целевые ячейки для получения изображения. Затем установите соответствующие экспериментальные параметры для каждой клетки-мишени, включая количество пикселей, длину волны возбуждения, процент пропускания, время экспозиции, толщину стека, временной интервал и общее время визуализации.
Отрегулируйте параметр экспозиции примерно на 2000–3000 отсчетов, чтобы достичь максимальной интенсивности пикселей. Чтобы свести к минимуму обесцвечивание флуоресцентных фотографий, максимально уменьшите процент пропускания возбуждающего света, сохраняя при этом время экспозиции менее одной секунды. Установите верхний и нижний предел стека Z на каждой целевой ячейке, перемещая предметный столик микроскопа до тех пор, пока верхняя и нижняя части целевой ячейки не окажутся немного не в фокусе.
Очень важно свести к минимуму обесцвечивание флуоресцентных фотографий при гибели нейронов после светового изображения. На этом рисунке показано, что первичные культивируемые нейроны гипоталамуса были помечены маркером нейронов MAP2. Маркер нейронов гипоталамуса POMC и их коэкспрессия CCR5.
На колокализованном изображении видно, что CCL5 экспрессируется в POMC-положительных нейронах гипоталамуса. Эти изображения показывают экспрессию белка GFP-GLUT4 в нейронах гипоталамуса дикого типа и нейронах гипоталамуса CCR5 с двойным негативом. Нейроны стимулировали инсулином или CCL5.
Стрелки указывают на точечность GFP-GLUT4 при неврите до или после стимуляции инсулином или CCL5, а звездочками обозначена поверхностная точка GLUT4-GFP до или после стимуляции CCL5. После освоения эта лабораторная запись техники первичной клетки может быть сделана от одного до четырех часов, в зависимости от требований эксперимента и от того, правильно ли она сделана. Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению возможности охарактеризовать непосредственный эффект, вызванный лекарственными препаратами, в первичной клеточной культуре.
После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделить первичный нейрон гипоталамуса, нейрон гиппокампа и корковый нейрон. Помимо лаборатории, вы также можете узнать, как провести запись серийной молекулы в реальном времени при различных стимуляциях. Не забудьте надеть лабораторный халат и перчатки и часто использовать этанол, чтобы избежать загрязнения бактериями и грибком животных.
Также будьте очень осторожны при работе с покровными соскальзываниями и нейронами на протяжении всей этой процедуры.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол наблюдения за перемещением транспортера глюкозы 4 (GLUT4), меченного GFP, в первичных нейронах гипоталамуса в режиме реального времени после стимуляции инсулином. Также изучается роль CCR5 в сигнальном пути инсулин–GLUT4, что позволяет расширить представление о нейрональной регуляции инсулинового сигналинга и метаболизма, имеющих значение при сахарном диабете 2 типа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Эндокринология
Введение
- Исследование сосредоточено на механизмах транспорта GLUT4 в ответ на инсулин.
- В работе рассматриваются поведенческие и метаболические вопросы, связанные с сахарным диабетом 2 типа.
- Участие CCR5 в передаче инсулинового сигнала открывает новые терапевтические возможности.
- Первичные культуры нейрональных клеток позволяют свести к минимуму повреждения в ходе экспериментов.
Цель исследования
- Исследовать динамику трафика GLUT4 в ответ на инсулин.
- Оценить роль CCR5 в сигнальном пути инсулина.
- Углубить понимание влияния нейронов на регуляцию инсулина.
Используемые методы
- Для прижизненной визуализации использовали первичные культуры клеток гипоталамических нейронов.
- Изоляцию тканей мозга детенышей проводили в стерильных условиях.
- Прижизненная визуализация осуществлялась с помощью микроскопии с деконволюцией для отслеживания трафика GLUT4.
- Для наблюдения за эффектами во время визуализации клетки обрабатывали инсулином и CCL5.
- Для минимизации фотовыгорания были скорректированы ключевые экспериментальные параметры.
Основные результаты
- Был визуализирован транспорт GFP-GLUT4 в ответ на стимуляцию инсулином и CCL5.
- Наблюдения указали на колокализацию CCR5 с нейрональными маркерами, что влияет на транспорт GLUT4.
- Данное исследование выявляет потенциальную дисрегуляцию механизмов инсулиновой сигнализации, вызванную CCR5.
- Результаты подчеркивают критическую важность взаимодействий между нейрональной сигнализацией и метаболизмом.
Выводы
- Данное исследование позволяет в режиме реального времени наблюдать за инсулин-индуцированным траффиком GLUT4 в нейронах.
- Полученные результаты подчеркивают роль CCR5, что указывает на возможные направления терапии сахарного диабета 2 типа.
- Выводы исследования способствуют пониманию нейронных механизмов, влияющих на метаболические расстройства.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод позволяет визуализировать в режиме реального времени перемещение GLUT4 в первичных нейронах гипоталамуса, обеспечивая понимание механизмов нарушения инсулиновой сигнализации, имеющих значение при сахарном диабете 2 типа. Связывая сигнализацию хемокинов (CCL5) с динамикой нейрональных транспортеров глюкозы, этот подход способствует валидации мишеней в путях метаболических заболеваний ЦНС. Данный метод снижает риски при проверке гипотез на ранних этапах, предоставляя количественные данные о транслокации белков в живых клетках в условиях контролируемой стимуляции.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Исследование функциональной взаимосвязи между CCR5 и стимулируемым инсулином перемещением GLUT4 в гипоталамических нейронах.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность прямого наблюдения за динамикой белков в первичных клетках, снижая зависимость от суррогатных систем.
- Прогностическая ценность: Способствует механистическому снижению рисков при разработке мишеней ЦНС, участвующих в метаболической регуляции.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные об эффективности транслокации GLUT4 в мембрану при стимуляции инсулином или хемокинами.
- Практическая ценность: устанавливает воспроизводимый метод прижизненной визуализации для отслеживания динамики транспортеров в нейрональных моделях.
- Готовность анализа: предоставляет данные тайм-лапс микроскопии с пространственным разрешением, подходящие для профилирования эффектов соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: устанавливает связь между дисбалансом периферических хемокинов и дефектами центральной инсулиновой сигнализации в соответствующей данной патологии нейрональной модели.
- Практическая ценность: использование первичных гипоталамических нейронов моделей дикого типа и моделей с дефицитом CCR5 для оценки генотип-зависимых ответов.
- Трансляционная преемственность: связывает результаты исследований in vitro с патофизиологией ожирения и сахарного диабета 2 типа in vivo.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод встраивается в рабочие процессы раннего этапа поиска, позволяя подтверждать гипотезы до идентификации ведущих соединений и проведения доклинических испытаний эффективности в рамках программ по изучению метаболических заболеваний.
- Открытия в биологии: Тестирование механистических связей между хемокиновыми рецепторами и инсулин-регулируемым транспортом глюкозы в нейронах.
- Скрининг: Обеспечение количественных конечных точек на основе визуализации для оценки влияния соединений на трафик GLUT4.
- Аналитика: Предоставление измерений интенсивности пунктат GFP-GLUT4 и мембранной локализации для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: Соответствие доклиническим моделям за счет использования первичных нейронов, отражающих паттерны коэкспрессии CCR5 и POMC в нейронах.
- Корпоративное повторное использование: Создание масштабируемой платформы для живой визуализации, применимой к другим флуоресцентно меченным транспортерам или рецепторам в культурах нейронов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов в отношении гипотез о мишенях за счет визуализации динамики белков в режиме реального времени в физиологически значимых клетках.
- Операционная ценность: стандартизирует протоколы визуализации живых клеток с определенными параметрами возбуждения, экспозиции и z-стекинга для минимизации фотообесцвечивания.
- Стратегическая ценность: служит основанием для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), выявляя, модулирует ли мишень передачу инсулиновых сигналов в ключевых популяциях нейронов.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию метаболических методов терапии, направленных на ЦНС, с учетом рисков, основываясь на механистических доказательствах, полученных на релевантных моделях нейронов человека.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области изоляции первичных нейронов, стерильной работы с тканями и флуоресцентной микроскопии живых клеток.
- Необходим доступ к системам деконволюционной микроскопии с иммерсионными масляными объективами 60x и системами контроля окружающей среды.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами процессов подготовки клеток, времени стимуляции и параметров получения изображений.
- При сравнении условий необходимо учитывать вариабельность эффективности трансфекции первичных клеток и базового уровня экспрессии GLUT4.
- Метод ограничен рисками фототоксичности при длительной визуализации, которые минимизируются путем оптимизации интенсивности возбуждения и времени экспозиции, как описано в протоколе.
