Изучая гипоталамуса инсулин сигнал периферийных глюкозе с системой непрерывной наркотиками вливания в мозг мыши

Общая цель данного эксперимента заключается в изучении роли передачи сигналов C-C-L-5 гипоталамусом в функции инсулина в периферической системе и метаболизме глюкозы путем манипулирования передачей сигналов C-C-L-5 путем введения антагониста Met-C-C-L-5 через межцеребральную желудочковую систему доставки, микроосмотический насос. Это лекарство может помочь ответить на ключевые вопросы в области биохимической физиологии, такие как хемокин C-C-L-5 в контроле метаболизма глюкозы в организме и реакции на инсулин в мозге. Основное преимущество этой меры заключается в том, что экспериментатор может легко манипулировать определенными сигналами в мозге в течение определенного периода времени, такими как C-C-L-5, без компенсаторного эффекта или развития расстройства, что обычно происходит, когда мы проводим генетические манипуляции у грызунов.

Визуальная демонстрация этой процедуры важна, так как введение микроосмотической помпы и точное измерение уровня инсулина и глюкозы в крови требует мастерства и точности. За день до операции подготовьте микроосмотические насосы для головного мозга, используя одномиллилитровый шприц и тупую иглу, чтобы наполнить насосы искусственной спинномозговой жидкостью, или A-C-S-F. Затем погрузите насос в A-C-S-F и поместите его на шейкер для легкого встряхивания в течение ночи.

На следующий день извлеките A-C-S-F из насоса и полностью заполните его заранее приготовленным раствором препарата, разведенным в A-C-S-F до тех пор, пока излишки не вытекут наружу. Затем с помощью хирургических ножниц разрежьте трубки катетера до желаемой длины. С помощью иглы для инфузии мозга с тупым концом прикрепите трубки к набору для инфузии мозга.

Затем заполните раствором препарата пробирки в инфузионном наборе. После сборки комплекта прикрепите его к микроосмотическому насосу. Наконец, чтобы предотвратить высыхание насоса, погрузите осмотический насос для инфузии мозга в A-C-S-F в стерилизованную 50-миллилитровую трубку.

Чтобы начать операцию, установите и закрепите голову мыши, находящейся под наркозом, на стереотаксическом аппарате. С помощью хирургических ножниц и клещей разрежьте внешнюю кожу, покрывающую череп. Затем используйте йод для очистки периферического черепа.

Затем используйте ножницы с тупой головкой в области шеи, чтобы отделить внешний слой кожи от подкожной кожи для имплантации набора для сращения мозга с помощью осмотического насоса. С помощью стереотаксического аппарата отметьте точку инфузии по карте мозга. С помощью дрели для ногтей просверлите отверстие вокруг отмеченной области на черепе, стараясь не повредить мозговые оболочки и кровеносные сосуды мыши.

Затем поместите набор для слияния мозга с микроосмотическим насосом, содержащий интересующий препарат, или A-C-S-F в качестве контроля, под кожу за областью шеи. Чтобы ввести препарат в мозг, введите иглу для инфузии мозга в просверленное отверстие. Используйте поверхностный десенсибилизирующий гель, чтобы зафиксировать иглу на месте на черепе и подождите, пока клей высохнет.

Отрежьте выступающую часть сверху иглы. Перед началом теста на толерантность к глюкозе приготовьте раствор глюкозы, растворив 3,75 грамма глюкозы и 15 миллилитров дистиллированной воды. Составьте расписание с соответствующими интервалами между каждым исследованием крови, чтобы записывать показания во время эксперимента.

Затем взвесьте каждую мышь после голодания, чтобы рассчитать подходящее количество глюкозы для инъекции. Затем на рабочем столе подготовьте таймер, глюкозный чип, глюкометр, инсулиновый шприц и бритвенные лезвия. Чтобы измерить уровень глюкозы в крови, сначала вставьте новый глюкозный чип в глюкометр и нажмите кнопку запуска, чтобы установить ноль.

Затем возьмите мышь за заднюю часть шеи и погладьте ее хвост, чтобы обеспечить достаточный приток крови. С помощью нового лезвия бритвы отрежьте небольшой кусочек хвоста, а затем выдавите каплю крови в глюкозный чип. Используя технику внутрижелудочного промывания кишечника, подайте мышке глюкозу и немедленно запустите таймер.

Измеряйте уровень глюкозы в разные моменты времени. Чтобы начать тест на толерантность к инсулину, приготовьте 0,25 единицы раствора человеческого инсулина. Затем взвесьте каждую мышь после голодания, чтобы рассчитать подходящее количество инсулина для инъекции.

Затем составьте график записи показаний во время эксперимента. Наконец, после инъекции инсулина измерьте уровень глюкозы в крови, как это делалось ранее. Метаболизм глюкозы измеряли с помощью перорального теста на толерантность к глюкозе после операции, после перорального введения глюкозы у мышей.

Изменения уровня глюкозы в крови у мышей, получавших A-C-S-F или антагонист C-C-L-5, зарегистрированы и показаны здесь. Также был проведен тест на чувствительность к инсулину, и уровень глюкозы в крови у мышей, получавших антагонист C-C-L-5, был лишь незначительно снижен по сравнению с контрольными мышами, что свидетельствует об ухудшении функции инсулина на периферическом метаболизме глюкозы у мышей, получавших C-C-L-5. Для анализа активации сигнала инсулина в гипоталамусе оценивали белок субстрата рецептора инсулина, или фосфорилирование I-R-S-1.

У мышей, получавших антагонист C-C-L-5 при нормальном кормлении, фосфорилирование I-R-S-1 было повышено по сравнению с контрольной группой. Для дальнейшего анализа активации сигнала инсулина также оценивали уровни фосфорилированного серина 4-7-3 Akt, сигнальной молекулы инсулина, расположенной ниже по потоку. После этого сигнал инсулина A-K-T был повышен у мышей контрольной группы, получавших A-C-S-F, но не у мышей, получавших антагонист C-C-L-5.

После того, как вы освоите введение микроосмотического насоса, потребуется всего полчаса, если все сделано правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно убедиться, что голова мыши слегка приподнята, а позвоночник находится прямо на стереотаксическом аппарате. Этот метод предоставляет исследователю способ в эндокринологии изучить действие лекарственного препарата, хемокина или белковой функции в мозге грызуна.

После этой процедуры можно провести дополнительные меры, такие как манипулирование экспрессией генов с помощью внутримозговой доставки вируса или CRISPER 9, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как как участие C-C-L-5 и рецептора C-C-L-5 в схемах переваривания и метаболизма пищи?