Синтез ядро оболочка легированный лантаноиды Upconversion нанокристаллов для сотовых приложений

Общая цель этой процедуры заключается в синтезе нанокристаллов апконверсии, легированных ядром и оболочкой, основанных на высокотемпературном подходе совместного осаждения, и в выполнении биосовместимых модификаций поверхности, которые обеспечивают дальнейшие клеточные приложения. За последние несколько лет наша лаборатория разработала уникальную апконверсию нанокристаллов, легированную лантаноидами, которая демонстрирует очень уникальные оптические свойства, которые могут поглощать длинноволновый инфракрасный свет и в основном преобразовывать этот свет в многоцветные излучения в коротковолновом диапазоне, включая ультрафиолетовое излучение, видимое даже инфракрасными световыми окнами. Такие уникальные нанокристаллические структуры указывают на очень многообещающие свойства для биомедицинских приложений.

Этот метод обеспечивает осуществимый подход к синтезу наноструктур апконверсии ядра и оболочки и их биосовместимый метод модификации поверхности для регуляции белка мембранного канала светового затвора при освещении ближним инфракрасным светом. Для начала процедуры приготовьте стоковые растворы редкоземельных ацетатных комплексов в метаноле. Приготовьте 20 миллиграмм на миллилитр растворов гидроксида натрия и фторида аммония в метаноле.

Храните исходные растворы при температуре четыре градуса Цельсия. Затем пипеткой наберите три миллилитра олеиновой кислоты и семь миллилитров 1-октадецена в 50-миллилитровую колбу с круглым дном с тремя горлышками. Добавьте к этому 1,089 миллилитров раствора ацетата иттрия, 0,608 миллилитров раствора ацетата иттербия, 83,6 микролитра раствора ацетата тулия и 128,5 микролитров раствора ацетата неодима.

Оснастите колбу мешалкой и термометром. Нагрейте колбу до 100 градусов Цельсия на масляной бане, помешивая, пока метанол не испарится. Затем подключите колбу к трубопроводу Schlenk и откачайте ее в течение двух-трех минут, чтобы удалить остатки метанола.

Далее поставьте колбу под атмосферу азота. Нагрейте реакционную смесь до 150 градусов Цельсия в течение одного часа, помешивая со скоростью 700 об/мин. Затем дайте смеси остыть до комнатной температуры.

Далее поместите в 15-миллилитровую центрифужную пробирку два миллилитра исходного раствора гидроксида натрия и 2,965 миллилитра стокового раствора фторида аммония. Плотно закройте трубку крышкой и перемешайте гидроксид натрия и фторида аммония в течение пяти секунд. В течение пяти минут с помощью стеклянной пипетки медленно добавляйте смесь гидроксида натрия и фторида аммония в реакционную колбу, помешивая.

Затем нагрейте реакционную смесь до температуры не более 50 градусов Цельсия. Подержите смесь при такой температуре 30 минут. Затем нагрейте смесь до 100 градусов Цельсия, чтобы испарить метанол.

Подключите колбу к трубопроводу Schlenk и удалите остатки метанола под вакуумом в течение двух-трех минут. Наполните колбу газообразным азотом и нагрейте реакционную смесь до 290 градусов Цельсия со скоростью пять градусов Цельсия в минуту. Подержите смесь при температуре 290 градусов Цельсия или чуть выше в течение 1,5 часов.

Затем дайте смеси остыть до комнатной температуры во время помешивания. Переложите смесь продукта в 50-миллилитровую центрифужную пробирку. Промойте остатки в пробирке с 30 миллилитрами этанола.

Центрифугируйте смесь при 4 000 г в течение восьми минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и диспергируйте твердые вещества в 10 миллилитрах гексанов с помощью ультразвука в течение двух минут. Добавьте в дисперсию 30 миллилитров этанола, снова центрифугируйте смесь в тех же условиях, а надосадочную жидкость выбросьте.

Диспергируйте твердые вещества в пяти миллилитрах гексанов и храните дисперсию при четырех градусах Цельсия. Проверьте преобразованное излучение раствора UCN с ядром и оболочкой при лазерном облучении 808 нанометров в темноте. Чтобы начать приготовление DBCO-модифицированных UCN, промыть подготовленные нанокристаллы ядро-оболочка в 30 миллилитрах этанола путем центрифугирования.

Выбросьте надосадочную жидкость, а в нее добавьте 10 миллилитров водного раствора соляной кислоты с pH четырех. Обработайте смесь ультразвуком в течение 30 минут, чтобы растворить твердые вещества. Переложите смесь в стеклянный флакон и энергично помешивайте в течение двух часов.

Затем смойте смесь четырьмя 30-миллилитровыми порциями диэтилового эфира. Соедините эфирные фракции, а промытый водный слой отложите в сторону. Извлеките UCN, не содержащие следовых лигандов, из слоев эфира с помощью 10 миллилитров деионизированной воды и объедините водные слои.

Добавьте в объединенные водные слои 20 миллилитров ацетона, и перебейте смесь в течение пяти секунд. Центрифугируйте смесь при 35 000 г в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и растворите осадок в двух миллилитрах деионизированной воды, чтобы получить раствор UCN, не содержащих лигандов.

Далее растворите 200 миллиграмм полиакриловой кислоты в 20 миллилитрах деионизированной воды методом ультразвука в течение 20 минут. Добавьте к этому раствор безлигандных UCN при энергичном перемешивании. Отрегулируйте рН смеси до 7,4 с помощью одномолярного раствора гидроксида натрия.

Обрабатывайте смесь ультразвуком в течение 30 минут, и помешивайте смесь в течение 24 часов при комнатной температуре. Затем центрифугируйте смесь при 35 000 г в течение 10 минут. Твердые вещества промыть центрифугированием в 10 миллилитрах деионизированной воды четыре раза.

Диспергируйте промытые твердые вещества в восьми миллилитрах деионизированной воды, чтобы получить 10 мг на миллилитр раствора полимер-модифицированных UCN. Центрифугируйте один миллиграмм модифицированных полимерами UCN в дозе 35 000 раз g в течение 10 минут. Храните оставшийся раствор при температуре четыре градуса Цельсия.

Промыть твердые вещества центрифугированием в одномиллилитровых порциях сухого ДМФА три раза. Затем растворите осадок в 200 микролитрах сухой ДМФА. Добавьте в этот раствор 12,2 миллиграмм HOBT, 14 миллиграмм EDC, пять миллиграмм DBCO-амина и 16 микролитров DIPEA.

Перемешайте смесь при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем центрифугируйте смесь в течение 10 минут при 35 000 раз изг. Промойте твердые вещества четыре раза центрифугированием в порциях ДМСО объемом в один миллилитр.

Диспергируйте модифицированные DBCO UHN в 0,2 миллилитрах ДМСО и храните дисперсию при четырех градусах Цельсия. Сначала посейте один раз по 10 пятых клеток HEK293 в 12-луночный планшет и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Затем в микроцентрифужной пробирке соедините один микрограмм выбранной плазмиды с двумя микролитрами трансфекционного средства P3000 в 100 микролитрах MEM.

В другой микроцентрифужной пробирке соедините 1,5 микролитра реагента для трансфекции со 100 микролитрами МЭМ. Выдерживайте обе смеси при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем соедините смеси и добавьте 400 микролитров МЕМ с низким содержанием сыворотки.

Далее дважды промойте инкубированные клетки одномиллилитровыми порциями бессывороточного DMEM. Распределите 600-микролитровую трансфекционную смесь по лункам 12-луночной пластины. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов.

Затем удалите среду и дважды промойте клетки порциями DMEM объемом в один миллилитр. Распределите по лункам один миллилитр тетраацетилированного N-азидоацетил-маннозаминного раствора в DMEM. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух суток.

Затем промойте, трипсинизируйте и повторно культивируйте клетки в конфокальной чашке в течение ночи. Затем замените среду одним миллилитром свежего DMEM, содержащим два микролитра 50-миллиграммового на миллилитр раствора DBCO-UCNs. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов, и дважды промойте клетки DMEM.

Выключите свет вытяжного шкафа и добавьте в клетки соответствующие диеновые буферные растворы для визуализации кальция, а затем инкубируйте клетки в течение 30 минут в темноте. Промойте клетки DMEM, не содержащим сыворотки. Облучайте ячейки 808-нанометровым ближним инфракрасным светом мощностью 0,8 Вт на квадратный сантиметр.

Чередуйте пятиминутное облучение с пятиминутными перерывами до тех пор, пока клетки не будут облучены в течение 20 минут. Визуализируйте клетки с помощью конфокального микроскопа. Просвечивающая электронная микроскопия ядра и ядра-оболочки UCN показала сферические структуры с толщиной оболочки около пяти нанометров.

ПЭМ с высоким разрешением показал d-расстояние, согласующееся с высококристаллизованными наноструктурами. После модификации поверхности UCN легко диспергировались в буферном растворе. Динамическое рассеяние света показало, что гидродинамический диаметр DBCO-UCN в водном растворе составляет около 96 нанометров.

Дзета-потенциалы ПАА и модифицированных DBCO UCN указывают на отрицательно заряженные поверхности, что согласуется с растворимостью и стабильностью в водных буферных растворах. Тесты на преобразованную эмиссию показали, что модифицированные PAA и DBCO UCN имеют те же схемы излучения, что и UCN с ядром и оболочкой при облучении 808-нанометровым светом. Меченные азидами клетки HEK293, экспрессирующие белки светозависимых каналов, были использованы для тестирования биоприменения DBCO-UCNs.

Локализация UCN на азидных метках была связана с окрашиванием групп DBCO азидсодержащим красителем. Когда эти клетки подвергались воздействию ближнего инфракрасного света, DBCO-UCN облегчали поток ионов кальция через клеточную мембрану, как показали конфокальная визуализация и проточная цитометрия с флуоресцентным индикатором кальция. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как получить нанокристаллы апконверсии ядра-оболочки с биосовместимой модификацией поверхности и их дальнейшее биоприменение для активации светового ионного канала в живых клетках с помощью этой процедуры.