Определение генома всей стенограммы распада ставок в пролиферирующих и покоя фибробластов

Общей целью этой процедуры является мониторинг скорости распада транскрипта в пролиферирующих и неактивных фибробластах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярной биологии, такие как являются ли изменения в экспрессии генов результатом изменений в скорости распада транскрипта. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он предоставляет информацию о скорости распада транскрипта, а не только об его распространении.

Для начала протокола установите пролиферирующие и неактивные культуры фибробластов. Пролиферирующие фибробласты следует регулярно трипсинизировать. Неактивные культуры можно создать, позволив планшетам достичь слияния с регулярными изменениями среды.

Добавьте ActD 150 микролитров в предварительно подогретую среду 10 миллилитров для всех биологически реплицируемых клеточных культуральных планшетов. Добавьте ActD в концентрации 15 мкг на миллилитр среды. Хорошо перемешайте раствор.

Аспирируйте старую среду и добавьте в клетки среду, содержащую ActD. Чтобы собрать образец нулевого временного значения, осторожно отсадите среду ActD и нанесите пипеткой от пяти до 10 миллилитров предварительно подогретого PBS на 100-миллиметровую пластину, пять миллилитров раствора на 100-миллиметровую пластину, два миллилитра на лунку шестилуночной пластины и один миллилитр на лунку 12-луночной пластины. Аккуратно аспирируйте PBS.

Затем добавьте раствор фенол-гуанидина изотиоцианата непосредственно в планшет для культуры тканей. Пипеткой несколько раз подавайте клеточную смесь раствора фенола-гуанидина изотиоцианата вверх и вниз, чтобы получилась однородная смесь. Соберите каждый момент времени по прошествии соответствующего количества времени, используя метод, описанный ранее.

Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение пяти минут, чтобы обеспечить полное растворение белковых комплексов РНК. Затем введите контролируемые с помощью спайковых транскриптов, которые могут быть обнаружены с помощью используемой методологии. Вводите эти элементы контроля в каждую пробу в известном количестве и концентрации.

С помощью пипетки перенесите смесь раствора фенилгуанидина изотиоцианата в микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 миллилитров. Затем добавьте 0,2 миллилитра хлороформа в смесь раствора фенилгуанидина изотиоцианата на каждый один миллилитр используемого раствора фенилгуанидина изотиоцианата. Энергично встряхивайте микроцентрифужную пробирку в течение 15 секунд, а затем инкубируйте хлороформ фенилгуанидинизотиоцианат.

После инкубации вращайте образцы при температуре 12 000 раз больше g в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Образец должен разделиться на три слоя. Перенесите водный слой в новую микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 миллилитров с помощью микропипетки и будьте осторожны, чтобы не нарушить интерфазу во время этого процесса.

Отбросьте межфазную и органическую фракции. Затем добавьте равный объем 2-пропанола к водной фракции и переверните трубку в 10 раз. Добавьте до одного микролитра 20 миллиграмм на миллилитр водного гликогена на 20 микролитров образца, особенно если ожидается низкий выход

Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут. После инкубации прокрутите образцы. Убедитесь, что в конце отжима РНК выпала в осадок и образовала некоторое количество гранул на дне трубки.

С помощью пипетки извлеките и выбросьте надосадочную жидкость, уделяя особое внимание тому, чтобы не потревожить белую гранулу РНК. Добавьте один миллилитр 75%-ного этанола на один миллилитр раствора фенилгуанидина изотиоцианата реагента для промывки гранулы. Вращайте образцы при 12 000 раз g в течение 10 минут.

После удаления большей части надосадочной жидкости используйте пипетку, чтобы удалить как можно больше этанола, но не беспокойте гранулы. Вращает образцы для удаления излишков этанола. На этом этапе гранула РНК менее компактна и имеет тенденцию к движению.

После отжима удалите весь излишки этанола из трубки, не потревожив гранулы. Дайте грануле РНК высохнуть на воздухе в течение пяти минут. Добавьте 50 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, к грануле РНК и повторно суспендируйте гранулу в воде без нуклеаз.

Обработайте образцы одним микролитром Дианазы для удаления ДНК, а затем инактивируйте Дианазу и катионы. Храните образцы РНК в микроцентрифужных пробирках объемом 2,0 миллилитра при температуре минус 80 градусов Цельсия. Количественно определите РНК и проверьте РНК на чистоту с помощью спектрофотометра.

После проверки чистоты проанализируйте РНК с помощью 1%-ного агарозного геля, чтобы визуализировать степень деградации. Две четкие полосы, представляющие 18S и 28S рРНК, должны быть четко видны. Если эти полосы не видны, РНК может деградировать.

Затем контролируйте распространенность транскрипта в собранных аликвотах РНК по сравнению с внутренним стандартом с шипами с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Также можно использовать микрочипы, секвенирование РНК или норн-блоттинг. Интенсивность флуоресценции с течением времени соответствует экспрессии генов.

В то время как фибробласты становятся контактно-ингибированными, кодирующий транскриптов коллаген 3A1, очень важный ген для создания внеклеточного матрикса, откладывающегося во время заживления ран, становится более стабильным и не распадается так быстро. Не забывайте, что работа с фенолом может быть чрезвычайно опасной, и важно не позволять ему касаться вашей кожи. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как контролировать скорость распада транскрипта в пролиферирующих и покоящихся фибробластах.

Изменения в скорости распада транскрипта могут быть важным механизмом триангуляции генов.