Структурные характеристики Маннан полисахаридов клеточной стенки в растений с использованием ПАСЕ

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы охарактеризовать полисахариды клеточной стенки растений. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области биологии клеточной стенки растений, включая структуру и количество глюкоманнана. Главное преимущество этой методики заключается в том, что она не требует специальной подготовки или дорогостоящего оборудования.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности с интерпретацией гелей, поэтому включение и понимание всех описанных элементов контроля имеет решающее значение. Спирт и растворимый остаток, или AIR, предварительно получают из собранного растительного материала, как описано в текстовом протоколе. Взвесьте шесть миллиграммов AIR в 15-миллилитровую центрифужную пробирку и добавьте воды до конечной концентрации два миллиграмма на миллилитр.

Vortex для достижения равномерной подвески. Аликвота 500 мкг в микрофуговые пробирки. Высушите аликвоты с помощью вакуумной центрифуги при температуре 30 градусов Цельсия в течение ночи.

Предварительно обработайте AIR, включая аликвоту для контроля без ферментов AIR одним моляром гидроксидом натрия в течение одного часа при комнатной температуре. Через час добавьте 200 микролитров воды и 20 микролитров одной молярной соляной кислоты в каждую трубку, чтобы нейтрализовать гидроксид натрия. Проверьте, что pH составляет от шести до семи, удалив один микролитр и нанеся его на бумажные полоски индикатора pH.

Добавьте 50 микролитров одного молярного буфера ацетата аммония pH 6,0, и добавьте воду в общем объеме 500 микролитров в каждую пробирку. Чтобы начать эту процедуру, добавьте заранее определенное количество маннаназ в аликвоты AIR и буфер. Включите соответствующий негативный контроль, а также позитивный контроль.

Закрутите вихрь, а затем кратковременно вращайте, чтобы собрать реакционную смесь на дне пробирки. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия с легким перемешиванием в течение ночи. На следующий день остановите реакцию, инкубируя при температуре 95 градусов Цельсия в течение 20 минут.

Центрифугируйте на максимальных оборотах в течение 10 минут. Сохраните надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую гранулу в 250 микролитрах воды. Снова центрифугируйте и сохраните надосадочную жидкость.

Соедините обе надосадочные жидкости и просушите в вакуумной центрифуге при температуре 30 градусов Цельсия около трех часов. Перед процедурой дериватизации подготовьте необходимые реагенты, как описано в текстовом протоколе. Подогрейте стоковый раствор 0,2 моляра ANTS до 60 градусов Цельсия до полного растворения твердого вещества.

К каждому образцу добавьте пять микролитров ANTS, пять микролитров двухпиколина-борана и 10 микролитров дериватизационного буфера. Коротко вращайте, чтобы собрать на дне трубки, тщательно закручивайте, а затем снова коротко вращайте. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в защищенном от света месте.

На следующий день высушите образцы в вакуумной центрифуге при температуре 30 градусов Цельсия в течение примерно двух часов. Суспендируйте каждый образец в олигосахариде стандарта и 100 микролитрах трехмолярной мочевины. Хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия в защищенном от света месте до тех пор, пока это не потребуется.

Сборка оборудования для литья геля будет зависеть от бренда. Для оборудования, используемого в этой демонстрации, один гель равен 50 миллилитрам. В 50-миллилитровой центрифужной пробирке смешайте 20,2 миллилитра воды, пять миллилитров 10-кратного буфера PACE, 24,6 миллилитра 40% акриламида/бис-акриламида, 200 микролитров APS и 20 микролитров TEMED.

Аккуратно переворачивайте для перемешивания, стараясь не вводить пузырьки воздуха. С помощью серологической или другой пипетки большого объема налейте разрешающий гель примерно на четыре сантиметра ниже верхней части стеклянных пластин. Тщательно покройте гель изопропиловым спиртом.

Дайте гелю полимеризоваться в течение 20-30 минут. Слейте верхний слой. Высушите лишнюю жидкость с помощью промокательной бумаги.

Далее сделайте укладку геля. В 15-миллилитровой центрифужной пробирке смешайте 6,8 миллилитра воды, один миллилитр 10-кратного буфера PACE, 2,8 миллилитра акриламида/бис-акриламида, 80 микролитров APS и восемь микролитров TEMED. Переверните для смешивания и наложите поверх полимеризованного разрешающего геля.

Аккуратно вставьте расческу, избегая попадания пузырьков воздуха под зубья расчески. После того, как гель полимеризуется, заверните его во влажную ткань, а затем в пищевую пленку и храните при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока не потребуется. Чтобы отслеживать порядок загрузки и определять, где находятся скважины после снятия гребня, используйте перманентный маркер для обозначения положения скважин на стекле.

Снимите расческу. Заполните лунки буфером one-X PACE. С помощью микрошприца объемом 10 микролитров загрузите в лунки два микролитра стандартов и образцов.

Избегайте использования самых внешних полос, которые обычно плохо выполняют выборки, и оставляйте пустую полосу между сэмплами. Соберите верхнюю камеру устройства для запуска геля и поместите гель в охлаждаемый резервуар, содержащий один буфер X PACE. Заполните верхнюю камеру буфером one-X PACE.

Включите питание и запустите гель при напряжении 200 вольт в течение 30 минут. Через 30 минут увеличьте напряжение до 1 000 вольт на один час и 40 минут. Беречь гель от света.

Начните с протирания гелевой системы визуализации влажной безворсовой салфеткой, чтобы убедиться, что она не содержит пыли. Извлеките гель из резервуара PACE и кратковременно посмотрите, пока гель все еще находится в стеклянных пластинах, чтобы определить, есть ли на геле фронт красителя. Используйте клиновидный инструмент, чтобы открыть гель, и, пока гель все еще находится на одной стеклянной пластине, используйте нож для пиццы, чтобы удалить как стекающий гель, так и дно геля, если лицевая сторона красителя все еще находится на геле.

Нанесите около пяти миллилитров воды на поверхность трансиллюминатора, а затем перенесите гель непосредственно на трансиллюминатор. С помощью программного обеспечения установите фильтр на UV 605 и включите длинноволновый ультрафиолетовый трансиллюминатор. Сделайте несколько снимков с разным временем экспозиции, обязательно выключая ультрафиолетовое излучение между изображениями, чтобы не ухудшить флуоресценцию.

Убедитесь, что по крайней мере два изображения не имеют насыщенных полос. Сохраните файлы в формате TIFF с высоким разрешением. Показан репрезентативный гель стандартного анализа PACE на содержание маннана в клеточной стенке.

На первый, втором и третьем дорожках показана лестница коммерчески приобретенных олигосахаридов с концентрациями 5, 10 и 50 пикомол соответственно. На четвертой дорожке показано расщепление маннаназой конжакового глюкоманнана, которое служит положительным контролем как для ферментативного расщепления, так и для реакции дериватизации в присутствии фермента и буферных солей. На пятом дорожке показан отпечаток PACE стебля дикого типа Arabidopsis.

На шестой дорожке показан отпечаток PACE стебля растения Arabidopsis, в котором отсутствует основная стеблевая маннансинтаза. По сравнению с диким типом, присутствует лишь небольшое количество маннана, о чем свидетельствует сниженная интенсивность полос для всех олигосахаридов, полученных из маннаназы. На дорожке 10 показан отпечаток PACE соснового дерева, который содержит галактоглюкоманнан и имеет рисунок высвобожденных олигосахаридов, явно отличающийся от такового у Arabidopsis.

Полосы 7, 8, 9 и 11 представляют собой различные отрицательные контрольные полосы, которые выявляют неспецифические полосы, отмеченные звездочками, которые должны быть исключены из анализа. После просмотра этого видео у вас должно сложиться действительно хорошее понимание того, как анализировать структуру маннана с помощью PACE. После освоения этой техники ее можно применять к другим полисахаридам, представляющим интерес, с использованием различных гликозилгидролаз.

Мы добились успеха, применив эту технику ко многим другим видам растений в дополнение к арабидопсису, а также к другим нерастительным видам, таким как дрожжевой маннан.