Изменение ролик трубки метод для точно локализованы и повторяющиеся прерывистый изображений во время долгосрочного культуры срезы мозга в замкнутой системе

Общая цель этого модифицированного метода с использованием роликовых трубок для культивирования срезов мозга состоит в том, чтобы создать закрытую культуральную систему для долгосрочного выживания срезов с возможностью повторной визуализации флуоресценции с высоким разрешением. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы развития нейронов и нейродегенеративных расстройств, которые требуют наблюдения за одними и теми же нейронами с течением времени, такие как локализация ключевых белков, участвующих в формировании или потере синапсов.

Основными преимуществами этой методики являются полностью закрытая система культивирования, которая позволяет безопасно использовать вирусы для экспрессии белков, и использование фототравленых покровных стекол для локализации тех же клеток для визуализации. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы культивировали срезы на покровных стеклах внутри роликовых трубок, но нам нужен был лучший способ визуализации изменений, происходящих в живых срезах с течением времени. Широкое использование вирусных векторов для экспрессии трансгенов и специфических клеточных популяций для визуализации под микроскопом привело нас к разработке закрытой системы для защиты пользователей и устранения загрязнения микроскопических объективов.

Возможность отслеживать идентичную популяцию клеток в срезах мозга с течением времени позволяет проводить исследования по развитию патологических изменений и изменению синапсов в моделях неврологических расстройств человека у грызунов. Для начала подготовьте штатив для роликовых труб и сделайте приспособление, чтобы помочь просверлить отверстие в роликовых трубах, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. С помощью приспособления удерживайте в нужном положении пластиковую пробирку с плоской стороной, в один сантиметр, так, чтобы плоская сторона была обращена вверх.

Затем просверлите отверстие диаметром шесть миллиметров с центром в одном сантиметре от дна и по центру между сторонами трубы. С помощью поворотного инструмента для снятия заусенцев сгладьте края отверстия и сделайте четыре канавки на внутреннем краю отверстия, чтобы облегчить дренаж отверстия во время вращения. Затем промойте пробирки 70% этанолом, а затем высушите их на воздухе в шкафу с биологической безопасностью.

Простерилизуйте трубки в 12-миллиметровых перфорированных клеевых силиконовых резиновых дисках в течение 40 минут под ультрафиолетовой лампой. Через 20 минут переместите трубки и диски так, чтобы все открытые поверхности были стерилизованы. Далее снимите белую подложку с клеевого диска, совместите отверстия и прикрепите силиконовую резину к внешней стороне трубки.

После того, как ломтики будут получены, поместите два микролитра куриной плазмы в центр фототравленой стороны подготовленного покровного стекла. Слегка распределите плазму, чтобы получить пятно диаметром от трех до четырех миллилитров. Затем с помощью стерильного шпателя с узким концом приподнять подготовленный срез мозга.

Используйте закрытые щипцы, чтобы удерживать срез на кончике шпателя во время подъема среза. Прикоснитесь шпателем к пятну плазмы на покровном листе и закрытыми щипцами надавите на срез на покровный лист. Добавьте тонкий слой куриной плазмы на покровную крышку перед размещением среза и минимальное количество плазмы, обработанной тромбином, чтобы покрыть срез.

Если срез плавает, он не останется прилипшим после удаления облака. Далее смешайте в отдельной пробирке 2,5 микролитра плазмы и 2,5 микролитра тромбина. Быстро нанесите 2,5 микролитра этой смеси на срез и вокруг него и осторожно рассыпьте пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать его.

Снимите прозрачное пластиковое покрытие с открытой стороны силиконового каучукового клея, ранее прикрепленного к роликовой трубке. Затем наложите покровный лист со срезом мозга на клей, выровняв срез внутри отверстия. Чтобы обеспечить адгезию, мягко равномерно надавите на покровное стекло большим пальцем, равномерно надавливая на покровное стекло, и удерживайте его около одной минуты, перекладывая в шкаф биологической безопасности.

Давление на покровное стекло, чтобы приклеить его к трубке без утечки, должно быть правильным и поддерживаться достаточно долго, чтобы устранить воздушные каналы в выступе. Слишком большое давление приведет к тому, что покровное стекло треснет. В шкаф биологической безопасности добавьте 0,8 миллилитра полной нейробазальной питательной среды в каждую пробирку.

Затем подайте смесь 5% углекислого газа и 95% воздуха через стерильную ватную пипетку Пастера с пробкой, надежно удерживаемую зажимом. Используйте его для промывки трубки ролика газовой смесью и быстрого закрытия трубки по мере ее извлечения из пипетки. Далее наклейте на пробирки номер среза и номер штатива.

Вставьте трубки в роликовый стеллаж; обеспечение их геометрического баланса. Если есть нечетное количество трубок, добавьте пустые трубки для баланса. Поместите стеллажи в роликовый инкубатор с температурой 35 градусов Цельсия, при этом ролики поворачивают роликовый стеллаж со скоростью от 10 до 13 оборотов в час.

Наклоните инкубатор назад примерно на 5 градусов, подняв его переднюю часть на доску. Перенесите пробирку с культурой среза в специально изготовленный держатель пробирки, как показано здесь. Затем поместите держатель трубки в адаптер предметного стекла так, чтобы покровное стекло было перпендикулярно объективу во время съемки.

Затем плотно прижмите ползунок на адаптере к трубке, чтобы удержать трубку на месте. Используя четырехкратный объектив при пересвечивании в светлом поле, сфокусируйтесь на периоде сетки под срезом. Во время первого сеанса визуализации быстро просканируйте срез, чтобы найти и записать количество различных областей, где требуется более высокое увеличение.

После того, как области интереса будут определены, переместите сцену в первый квадрат сетки, содержащий область интереса. Затем переключитесь на цель 20 погрешности и найдите реперную отметку. Затем переключитесь на цель более высокой мощности, локализуйте ту же реперную метку и запишите положение предмета по осям X и Y.

Переместите рабочую область, чтобы найти другие поля интереса поблизости и записать их смещения x и y от реперной метки. Положения смещения позволяют постоянно определять одно и то же местоположение покровного стекла при изображении среза, даже несмотря на то, что исходная настройка x, y реперной метки изменяется при снятии и замене трубки или адаптера предметного столика. Захватите Z-стик изображения в каждом выбранном поле с помощью объектива микроскопа или пьезостолика, если таковой имеется.

Используя нейронный жизненный краситель, конфокальная комбинация изображений, показанная здесь, подчеркивает трехмерную архитектуру как нейритов, так и тела клетки, но окрашивание исключается из ядра. Для изучения зависящих от времени изменений морфологии ростового среза и жизнеспособности в срезах в течение длительного периода культивирования, один и тот же срез был помечен флуоресцентным нейронным витальным красителем один раз в неделю, за 24 часа до визуализации. Чтобы продемонстрировать воспроизводимость визуализации идентичных клеток с течением времени, одно и то же поле среза, помеченное нейронным витальным красителем на 13-й день, было визуализировано на 14, 15, 16 и 17 день.

Положение трех клеток в каждый день показано символом над ядром. В дополнение к нейронному жизненному красителю, вирус-опосредованные флуоресцентные белки могут быть использованы с этой системой для мечения клеток. В этом случае как чувствительный к кальцию репортер, так и палочки, содержащие кофилин, могут быть четко идентифицированы через 10 дней после заражения.

Успешное проведение этой процедуры требует предварительной подготовки всех пробирок, покровных стекол и растворов. Умение получать срезы за короткий промежуток времени после смерти также имеет решающее значение для успеха и требует большой практики. После освоения этой техники можно сделать примерно за 90 минут, чтобы получить 12-18 срезов гиппокампа от щенка мыши, включая время на вскрытие и нанесение покрытия.

После этой процедуры срезы мозга могут быть инфицированы вирусами в разное время для достижения специфической для клеток экспрессии флуоресцентно меченых белков или тишины для экспрессии генов с помощью небольшой интерферирующей РНК или короткой РНК шпильки для зондирования функции генов. Не забывайте, что работа с рекомбинантными вирусами может быть опасной, и при работе с этими реагентами всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитных средств для глаз.