Целом гора очистки и окраски Arabidopsis цветок органов и Siliques

В этом протоколе описано, как правильно рассекать цветочные бутоны, цветы и молодые силики. И последующая сплошная расчистка для различных техник окрашивания и наблюдения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сексуального растениеводства.

Например, анализ на устойчивые мутанты или любой сбой в развитии и функционировании цветка, вызванный окружающей средой и экспериментом. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет легко и быстро отсеивать многие стадии развития одновременно. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы вскрытия органов цветка сложны для освоения, поскольку они требуют предварительных знаний анатомии цветка и навыков препарирования.

Для начала используйте маленькие ножницы, чтобы удалить цветы с синхронизированных растений. И сразу же поместить их в отдельные микроцентрифужные пробирки, содержащие соответствующий фиксатор. Далее снимите фиксатор и добавьте достаточное количество 70% этанола, чтобы полностью покрыть образцы.

Верните образцы при температуру в четыре градуса Цельсия не менее чем на 24 часа. Затем наполните стакан часовщика свежеприготовленным 70% этанолом и поместите его в маленькую чашку Петри для поддержки. Затем поместите соцветие в стакан часовщика и убедитесь, что он полностью покрыт этанолом.

С помощью щипцов и шприца, оснащенного иглой, препарируйте цветок под стереомикроскопом, оторвав чашелистики, лепестки и тычинки. Затем отложите часовое стекло в сторону и используйте предметное стекло для окончательного вскрытия. Переместите образец на предметное стекло и добавьте 10 микролитров свежеприготовленного 70%-ного этанола.

Сделайте надрезы с каждой стороны запястья, поворачивая его по мере необходимости. Затем аккуратно снимите клапаны, чтобы обнажить семяпочки. Сделайте небольшой резкий надрез, чтобы отделить половину передающей ткани от сосуда, и с помощью щипцов и иглы разорвите две половины.

Удалите рыльце и цветонос с острыми надрезами. С помощью щипцов и иглы аккуратно переверните и расположите еще прикрепленные семяпочки так, чтобы получилось два параллельных ряда. С помощью небольшого кусочка промокательной бумаги удалите этанол из образца на предметном стекле

Затем добавьте в горку 20 микролитров очищающего раствора. С помощью пары шприцев с иглами для подкожных инъекций расположите образцы и удалите оставшиеся пузырьки воздуха. Затем аккуратно наденьте защитное стекло на предметное стекло и подождите, пока очищающий раствор заполнит пространство между защитным стеклом и образцом.

Поместите предметное стекло в держатель слайда и оставьте его под вытяжным шкафом. Итак, давайте только что собранные цветочные бутоны, которые вот-вот раскроются с нераскрывающимися пыльниками. Затем приготовьте 96 луночную тарелку с достаточным количеством раствора Александра, чтобы полностью погрузить цветочные бутоны.

Удалите чашелистики и лепестки, чтобы обнажить пыльники и опустите их в раствор Александра. Оставьте пластину под вытяжным шкафом на один-три часа. Затем замените раствор Александра на раствор Герра четыре с половиной и инкубируйте тарелку под вытяжным шкафом на ночь.

На следующий день с помощью щипцов осторожно переместите очищенные бутоны на новое горное стекло. Далее рассекаем тычинки и удаляем из образцов все остальные ткани. Затем приступайте к очищению на основе хлоралгидрата и комбинированному окрашиванию с использованием раствора Герра четыре с половиной.

Сначала переместите цветок со стекла часовщика на предметное стекло и с помощью промокательной бумаги удалите излишки этанола. Добавьте от пяти до 10 микролитров раствора DAPI. С помощью двух шприцев с иглами для подкожных инъекций рассеките тычинки и удалите все остальные органы цветка.

Затем выпустите пыльцевые зерна в раствор DAPI. Удалите весь мусор с тычинки со предметного стекла, убедившись, что на предметном стекле остались только пыльцевые зерна. Удаление всех тычиночных остатков со предметного стекла является наиболее важным этапом для удаления экзина.

Между предметным стеклом и покровным стеклом следует оставлять только пыльцевые зерна. Затем поместите защитное накладку на ползун подшипника образца и добавьте минимальное количество раствора DAPI, необходимое для заполнения пространства между ползуном и защитным накладкой. Осторожно положите указательный палец на защитный лист и сделайте быстрое короткое скользящее движение.

Поместите предметное стекло в человеческий ящик в темноте при температуре четыре градуса Цельсия не менее чем на 15 минут. Затем наблюдайте за предметным стеклом под широким полем флуоресценции или конфокальной микроскопией в течение 24 часов. Переместите препарированный образец из стекла часовщика на стеклянную пластину с полостями, заполненными 1% SDS и 0,2 раствором гидроксида натрия.

Инкубировать в течение ночи при комнатной температуре. Раствор гидроксида натрия SDS быстро очистит образцы, сделав их прозрачными в течение нескольких минут. Тщательно промойте образец водой и поместите его на чистое предметное стекло.

Затем добавьте на предметное стекло от 20 до 40 микролитров раствора для окрашивания. В зависимости от анализируемого цветочного органа и навыков исследователя это лечение DS может быть проведено до, для опытных исследователей, или после этапа вскрытия для менее опытных исследователей. Затем наденьте на предметное стекло крышку, стараясь не раздавить препарат.

Затем поместите все подготовленные предметные стекла в человеческую коробку, покрытую алюминиевой фольгой, и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение одного часа. Наконец, наблюдайте за образцом с помощью широкого поля флуоресценции или конфокальной микроскопии. После процедуры диссекции, описанной в протоколе, удаляются ненужные ткани, которые могут препятствовать наблюдениям, и получаются более подробные изображения.

В зависимости от поставленной задачи, окрашивание хлоралгидратом может быть использовано для характеристики раннего развития цветка на уровне всей цветочной почки, мейоза и микрогомалеза в пыльнике, раннего развития семяпочек и спецификации материнской клетки мегаспоры, развития самки или даже инвазии пыльцевых трубок в центральную сетку. Совместное окрашивание по Александеру и четыре с половиной расчистки Герра позволяет оценить аборт пыльцы в пределах данной долеки или пыльника в целом. В то время как жизнеспособные пыльцевые зерна имеют красную цитоплазму, абортированные имеют пустую цитоплазму, и в конечном итоге они имеют неправильную форму и полностью раздавлены.

Удаление экзина приводит к увеличению интенсивности окрашивания ядер и улучшению деталей организации хроматина. Использование и очистка гидроксида натрия SDS перед окрашиванием сделали соцветия прозрачными. И приводило к более высокому окрашиванию каллозы в цветочных тканях.

В нем выявляются обычно трудно различимые скопления каллозы. Например, слой каллозы, который отделяет генеративную клетку от вегетативной. Даже когда пыльцевые зерна все еще содержались в пыльнике.

После освоения эти техники можно выполнить менее чем за 48 часов, если они выполнены правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что результаты во многом зависят от хорошей подготовки образца, такой как использование правильного фиксатора, правильное выполнение рассечения и изоляция интересующей ткани на предметном стекле.