Альтернативные в Vitro методы для определения вирусного капсида структурной целостности

Общая цель данных методов заключается в более глубоком изучении влияния обработки на инфекционность или целостность капсида норовируса человека. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области инактивации неконвертированных вирусов, например, о том, как меняется способность капсида вируса инфицировать клетку после определенной обработки.

Основным преимуществом этих методов является то, что они позволяют получить дополнительные сведения о механизме воздействия любого конкретного метода обработки на вирус. Хотя данный метод может дать понимание стратегий инактивации человеческого норовируса, он также может быть применен к другим не оболочечным вирусам, таким как риновирус или вирус гепатита A.

Для начала разведите очищенный основной белок капсида норовируса человека, собранный в капсиды, до концентрации 50 micrograms per milliliter в 1X фосфатно-солевом буферном растворе. Используйте максимальный объем 15 microliters в отдельных ПЦР-пробирках с крышками.

Убедитесь, что в пробирке содержится не менее 600 nanograms капсида и что на каждую комбинацию лиганда для обработки приходится 600 nanograms капсида. Затем предварительно нагрейте термоциклер до температуры, необходимой для термической обработки. После этого установите температуру 4 °C в другом термоциклере для немедленного охлаждения.

Поместите пробирки с раствором капсида в термоциклер на необходимое время. После нагрева немедленно перенесите пробирки в предварительно охлажденный до 4 °C циклер на пять минут. Кратковременно центрифугируйте пробирки, чтобы собрать все капли на дне.

Разведите растворы обработанных капсидов и PBS до концентрации 3 µg/mL. Убедитесь, что объем разведенного обработанного капсида составляет не менее 200 µL. Затем внесите по 100 µL раствора капсида в каждую лунку, обеспечив наличие как минимум двух лунок для каждого варианта обработки. Кроме того, для каждого лиганда добавьте две контрольные лунки с 100 µL PBS. Это необходимо для определения фонового поглощения в анализе. Накройте планшет крышкой и загерметизируйте края парафиленовой пленкой для уменьшения испарения. Оставьте планшет на ночь в шейкере-инкубаторе при температуре 4 °C или на два часа при комнатной температуре.

После инкубации удалите обработанные растворы капсидов из лунок планшета. Затем добавьте в каждую лунку по 200 µL блокирующего буфера. Инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре или в герметично закрытом виде при температуре 4 °C в течение ночи.

Тем временем разведите биотинилированный аптамер в воде, не содержащей нуклеаз, до концентрации 1 µM. Убедитесь, что приготовленного раствора достаточно для получения общего объема 200 µL на каждый вариант обработки.

Также разведите выбранный биотинилированный HPGA до концентрации 30 µL/mL в блокирующем буфере. Еще раз убедитесь, что приготовлено достаточное количество раствора для обеспечения общего объема 200 µL для каждого варианта обработки.

После инкубации удалите блокирующий буфер и трижды промойте планшет, используя по 200 µL PBST на лунку. Чтобы удалить остатки влаги, промокните планшет, перевернув его на стерильные бумажные полотенца. Затем добавьте по 100 µL растворов лиганда для связывания в каждую лунку, обеспечив наличие двух лунок для каждой комбинации температурной обработки и лиганда, и инкубируйте закрытый планшет на орбитальном шейкере при частоте около 60 RPM в течение одного часа при комнатной температуре.

После промывки лунок, как описано в текстовом протоколе, добавьте в каждую лунку 100 µL стрептавидина-пероксидазы хрена в концентрации 0.2 µg/mL в PBS.

Инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре при осторожном перемешивании на орбитальном шейкере, после чего снова промойте лунки. Затем, после еще одной промывки, добавьте в каждую лунку по 100 µL субстрата TMB и дайте цвету развиться в течение от 5 до 15 минут. Проверьте лунки на появление окрашивания.

Следите за тем, чтобы время проявления было одинаковым для всех повторных планшетов, и учитывайте диапазон поглощения используемого планшетного ридера. Остановите развитие реакции, добавив по 100 µL 1 M фосфорной кислоты в каждую лунку. Сразу после этого измерьте оптическую плотность планшета при 450 nm.

Создайте новую стандартную операционную процедуру определения размера в программном обеспечении прибора DLS, как подробно описано в текстовом протоколе. Затем выберите зеленую стрелку запуска в программе и присвойте образцу имя.

Разведите термообработанные вирусоподобные частицы (VLPs) в соотношении 1:10 в 1X PBS до конечной концентрации 5 µg/mL. Затем профильтруйте образец через фильтр с размером пор 1 мкм для удаления частиц пыли. Метод DLS очень чувствителен к пыли, так как крупные частицы рассеивают свет значительно сильнее, чем мелкие. Перенесите 50 µL разведенных VLPs в одноразовую кювету для малых объемов. Вставьте кювету в измерительную камеру прибора. Запустите измерение и используйте вкладки «correlogram cumulant fit» и «expert advice» для оценки качества данных. Во время анализа убедитесь, что индекс полидисперсности составляет менее 0.3, что свидетельствует о качественном измерении.

На вкладке Multiview убедитесь, что коэффициент корреляции остается постоянным и близок к единице, но не превышает ее, на коротком временном интервале, и резко падает до нуля в последующий период, что характерно для размера частиц. Используйте вкладку с советами эксперта для получения информации о качестве данных во время измерений. После завершения измерения снова проверьте, чтобы значение индекса полидисперсности было меньше 0,3.

Убедитесь, что линия аппроксимации кумулянт следует за точками данных на вкладке fit в окне кумулянт. Создайте новую стандартную рабочую процедуру измерения размера в программном обеспечении прибора DLS, как подробно описано в текстовом протоколе. Нажмите стрелку запуска в программе, чтобы открыть и присвоить имя новому образцу, и дождитесь достижения прибором температурного равновесия.

Перенесите суспензию VLP в кварцевую кювету малого объема, избегая образования пузырьков; медленно вносите жидкость по стенке кюветы. После того как прибор достигнет температурного равновесия, поместите кювету в отделение для образца. Подождите 10 секунд для стабилизации температуры образца, затем запустите измерение и одновременно включите таймер.

Остановите таймер по окончании первого измерения. Примите это значение как первую временную точку. Последующие временные точки определите по времени измерений, зафиксированному программным обеспечением.

Проведите термическую обработку, как указано ранее, за исключением того, что замените PBS на 10 миллимолярный HEPES (pH 7,4) и не разбавляйте капсиды после обработки. Затем перенесите всю 15 мкл каплю раствора обработанных капсидов на парафиновую пленку. Захватите край сетки пинцетом, плотно зажав его, и поместите сетку углеродной стороной вниз на каплю обработанного раствора.

Оставьте сетку инкубироваться в течение 10 минут, чтобы капсид прикрепился к ней. В зависимости от чистоты препарата капсида проведите промывку раствором HEPES, нанося капли объемом 10–15 µL в ряд вслед за каплей с обработанным капсидом. Через 10 минут заберите сетку вместе с каплей.

Расположите сетку почти перпендикулярно кусочку фильтровальной бумаги, чтобы удалить каплю. Затем с помощью сетки подберите каплю HEPES буфера объемом от 10 до 15 µL и выдержите ее в течение 30 секунд. По истечении 30 секунд промывки удалите остатки жидкости другим кусочком фильтровальной бумаги.

Затем на свободном участке парафиновой пленки поместите каплю 2% раствора уранилацетата объемом 15 µL. Погрузите сетку в каплю уранилацетата и выдержите ее в течение 45 секунд. Затем удалите излишки уранилацетата с помощью фильтровальной бумаги, стараясь убрать большую часть раствора.

Поместите сетку углеродной стороной вверх на лист фильтровальной бумаги, следя за тем, чтобы сетка не прилипла к влаге на пинцете. Затем поместите фильтровальную бумагу с сеткой в открытую стеклянную чашку Петри. Повторив этот процесс для всех вариантов обработки, поместите половины чашек Петри с сетками в эксикатор на ночь для высушивания перед проведением ПЭМ-анализа.

На следующем графике показано снижение способности капсидов норовируса человека к связыванию с течением времени при воздействии температуры 68 °C. Как видно, связывание с HPGA является первым сигналом, который полностью исчезает. Считается, что в этот момент подавляющее большинство капсидов в растворе утратило способность связываться с HPGA клеток хозяина и, следовательно, не может интернализироваться в клетку.

Связывание аптамера повторяет связывание HBGA, хотя для удаления сигнала требуется чуть более интенсивная термообработка. Здесь представлена кривая коэффициента корреляции DLS, репрезентативная для данных хорошего качества. В момент времени, близкий к нулю, коррелограмма постоянна при значении, близком к единице, но ниже её.

Затем он резко падает до нуля в время, характерное для размера частиц. Результатам определения размера, полученным в этом эксперименте, скорее всего, можно доверять. И наоборот, такая кривая коэффициента корреляции характерна для данных низкого качества.

Коррелограмма начинается со значения выше единицы и постепенно снижается до нуля. Результаты этого эксперимента не следует использовать. В данном случае данные о размере частиц демонстрируют выраженный профиль агрегации для капсидов, подвергнутых воздействию температуры 68 °C, при этом супер-агрегаты начинают образовываться примерно через 20 минут.

Время, при котором происходит супер-агрегация, характеризует восприимчивость VLPs к данному воздействию. На этом рисунке представлены результаты ПЭМ при термической обработке капсидов норовируса человека. Здесь капсиды подвергались воздействию температур от 60 до 80 °C (слева направо).

Как видно, морфология капсида явно изменяется в зависимости от обработки, так как капсиды агрегируют и денатурируют. Аналогичное явление наблюдается для капсидов, подвергнутых воздействию температуры 68 °C в течение от 0 до 25 минут.

После освоения эти методики могут быть выполнены в интервале от 1 до 24 часов при условии их правильного проведения.

После своей разработки эта методика предоставила исследователям в области вирусологии пищевых продуктов дополнительные возможности для изучения механизмов и эффектов инактивации капсида норовирусов человека. После выполнения данной процедуры могут быть проведены другие методы, такие как RT-PCR в реальном времени с предварительной обработкой РНказой или без нее, SDS-PAGE вирусных капсидов и анализ по wherever-методу с использованием культивируемых суррогатных вирусов, чтобы получить более полное представление об общем снижении титра вируса после определенной обработки. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать связывание лигандов, динамическое рассеяние света и просвечивающую электронную микроскопию для более глубокого понимания механизмов воздействия инактивирующей обработки на капсид норовируса человека.

Не забывайте, что работа с некоторыми из используемых реагентов может быть опасной, поэтому при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты и соблюдение правил техники безопасности в лаборатории.