Альтернативные в Vitro методы для определения вирусного капсида структурной целостности

Общая цель этих методов состоит в том, чтобы получить более глубокое понимание влияния лечения на инфекционность или целостность капсида норовируса человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области инактивации вируса без оболочки. Например, что происходит со способностью вирусного капсида заражать клетку после определенного лечения.

Основное преимущество этих методов заключается в том, что они могут дать дополнительное механистическое представление о действии любого конкретного лечения на вирус. Несмотря на то, что этот метод может дать представление о стратегиях инактивации норовируса человека, он также может быть применен к другим вирусам без оболочки, таким как риновирус или гепатит A.To началу, разбавленный очищенный основной капсидный белок норовируса человека, собранный в капсиды до 50 мкг на миллилитр в 1X фосфатном буферном растворе. Используйте максимальный объем 15 микролитров в отдельных закрытых ПЦР-пробирках.

Убедитесь, что пробирка содержит не менее 600 нанограммов капсида и что в каждой комбинации лиганда лечения содержится 600 нанограммов капсида. Далее разогрейте термоамплификатор до нужной термической обработки. Затем разогрейте дополнительный амплификатор до четырех градусов Цельсия для немедленного охлаждения.

Добавьте пробирки с раствором капсида в амплификатор на нужное время. После нагрева сразу же переложите трубки в предварительно охлажденный четыре градуса Цельсия амплификатор на пять минут. Кратковременно прокрутите пробирки в центрифуге, чтобы все капли попали на дно пробирки.

Разведите обработанные растворы капсида и PBS до трех микрограммов на миллилитр. Следите за тем, чтобы в нем было не менее 200 микролитров разведенного обработанного капсида. Далее нанесите по 100 микролитров раствора капсида на каждую лунку, следите, чтобы на одну обработку приходилось не менее двух лунок.

Кроме того, включите две контрольные лунки со 100 микролитрами PBS для каждого лиганда. Это обеспечивает фоновую абсорбцию анализа. Накройте тарелку крышкой и заклейте края парафиновой пленкой, чтобы уменьшить испарение.

Оставьте тарелку на ночь в встряхивающем инкубаторе при температуре четыре градуса Цельсия или на два часа при комнатной температуре. После инкубации извлеките обработанные растворы капсида из планшета. Затем добавьте 200 микролитров на лунку блокирующего буфера.

Выдерживать в течение двух часов при комнатной температуре или при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Тем временем разбавьте биотинилированный аптамер до одного микромоляра в воде, не содержащей нуклеаз. Убедитесь, что раствора достаточно для 200 микролитров в общей сложности для каждой процедуры.

Кроме того, разведите выбранную биотинилированную HPGA до 30 микролитров на миллилитр в блокирующем буфере. Опять же, убедитесь, что раствора достаточно на 200 микролитров общего объема для каждой процедуры. После инкубации снимите блокирующий буфер и трижды промойте планшет 200 микролитрами PBST на лунку.

Похлопайте тарелку вверх дном по стерильным бумажным полотенцам, чтобы высушить остатки влаги. Затем, при концентрации 100 микролитров на лунку растворов для связывания лигандов, гарантируя, что на комбинацию лигандов термической обработки приходится две лунки, инкубируйте покрытый планшет на орбитальном вибростенде со скоростью около 60 об/мин в течение одного часа при комнатной температуре. После промывки лунок, как описано в текстовом протоколе, добавить по 100 микролитров на лунку по 0,2 микрограмма на миллилитр стрептавидина хрен-пероксидазы и ПБС.

Выдерживать в течение 15 минут при комнатной температуре, осторожно встряхивая на орбитальном шейкере, перед повторной промывкой лунок. Затем, после еще одной промывки, добавьте 100 микролитров на лунку субстрата TMB и дайте цвету проявиться в течение пяти-15 минут. Следите за лунками на цвет.

Обязательно последовательно развивайте в течение одного и того же времени между репликационными пластинами и учитывайте диапазон поглощения используемого считывателя пластин. Остановить развитие реакции можно с помощью 100 микролитров на лунку одного моляра фосфорной кислоты. Сразу считайте показания пластины на 450 нанометрах.

Создайте новую стандартную операционную процедуру в программном обеспечении прибора DLS, как описано в текстовом протоколе. Затем выберите зеленую стрелку запуска в программном обеспечении и присвойте имя образцу. Разбавьте термически обработанные вирусоподобные частицы или VLP от одного до 10 в 1X PBS до конечной концентрации пять микрограммов на миллилитр.

Затем отфильтруйте образец с размером пор в один микрон, чтобы удалить частицы пыли. DLS очень чувствительна к пыли, так как крупные частицы рассеивают гораздо больше света, чем мелкие частицы. Перелейте 50 микролитров разведенных VLP в одноразовую кювету небольшого объема.

Вставьте кювету в камеру для образцов инструмента. Запустите прогон и используйте вкладки «Подгонка кумулятивной коррелограммы» и «Советы экспертов» для оценки качества данных. Во время выполнения убедитесь, что полидисперсия значения индекса меньше 0,3, что соответствует измерению качества.

На вкладке «Многовидовое представление» убедитесь, что коэффициент корреляции постоянен и близок к единице, но не превышает единицу в течение короткого периода времени, а затем резко падает на нуле, что характерно для размера частиц. Используйте вкладку «Советы экспертов» для получения обратной связи о качестве данных во время измерений. После завершения измерения еще раз проверьте при полидисперсии значения индекса меньше 0,3.

Убедитесь, что линия подгонки кумулятива точно повторяет точки данных на вкладке подгонки кумулятивов. Создайте новую стандартную рабочую процедуру в программном обеспечении прибора DLS, как описано в текстовом протоколе. Нажмите стрелку запуска в программном обеспечении, чтобы открыть и назвать новый образец и позволить прибору достичь температурного равновесия.

Перенесите суспензию VLP в кварцевую кювету небольшого объема, избегайте образования пузырей и медленно прижмите пипеткой к стенке кюветы. После того как прибор достигнет температурного равновесия, вставьте кювету в камеру для образца. Подождав 10 секунд, чтобы температура образца выровнялась, запустите прогон и одновременно запустите таймер.

Остановите таймер по окончании первого измерения. Возьмем это время в качестве первой временной точки. Получение последующих временных точек из времени измерений, записанных программным обеспечением.

Термическую обработку проводить так же, как и раньше, за исключением замены PBS для 10 миллимолярных куч, pH 7,4 и не разбавлять капсиды после обработки. Далее пипеткой нанесите всего 15 микролитров обработанного раствора капсида на парафиновую пленку. Возьмитесь за край сетки пинцетом, позволяющим им замкнуться на краю, чтобы удержать сетку, и положите угольную сторону сетки вниз поверх капли обработанного раствора.

Дайте сетке инкубироваться в течение 10 минут, чтобы капсид мог прикрепиться к сетке. В зависимости от чистоты капсидного препарата добавляют смывки кучного раствора в виде капель от 10 до 15 микролитров, размещенных в линию после обработанной капсидной капли. Через 10 минут подхватите сетку с каплей.

Поместите сетку почти перпендикулярно листу фильтровальной бумаги, чтобы отвести каплю. Затем с помощью сетки наберите каплю от 10 до 15 микролитров в буфер и подержите ее в течение 30 секунд. После 30 секунд стирки промойте другой лист фильтровальной бумаги.

Далее поместите на парафиновую пленку в пустом месте каплю двухпроцентного раствора уранилацетата объемом 15 микролитров. Подхватите капельку уранилацетата с помощью сетки и подержите ее в течение 45 секунд. Затем отведите уранилацетат, обязательно удалив большую часть раствора.

Положите угольную сторону сетки на лист фильтровальной бумаги, следя за тем, чтобы сетка не прилипла к влаге на пинцете. Затем поместите фильтровальную бумагу с сеткой на нее в открытую стеклянную чашку Петри. Повторив этот процесс для всех процедур, поместите половинки чашки Петри с решетками в эксикатор на ночь для сушки перед наблюдением с помощью ПЭМ.

На следующем графике показано снижение связывающей способности капсидов норовируса человека с течением времени при лечении при температуре 68 градусов Цельсия. Как видно, связывание HPGA является первым сигналом, который полностью исчезает. На данный момент предполагается, что подавляющее большинство капсидов в растворе утратили способность связываться с HPGA клетки-хозяина и, таким образом, не могут быть интернализованы в клетку.

Связывание аптамера отражает связывание HBGA, хотя для удаления сигнала требуется немного больше термической обработки. Здесь показана кривая коэффициента корреляции DLS, представляющая данные хорошего качества. В момент времени, близком к нулю, коррелограм постоянен при значении, близком к единице, но меньшем.

Затем он резко падает до нуля в момент, характерный для размера частиц. Размерным результатам этого эксперимента, вероятно, можно доверять. И наоборот, эта кривая коэффициента корреляции является репрезентативной для данных низкого качества.

Коррелограмма начинается со значения выше единицы и постепенно опускается до нуля. Результаты этого эксперимента не следует использовать. Здесь данные о размерах частиц показывают четкий профиль агрегации для капсидов, обработанных при температуре 68 градусов Цельсия, с суперагрегатами, образующимися примерно через 20 минут.

Время, в течение которого происходит суперагрегация, характерно для восприимчивости VLP к этому лечению. На этом рисунке визуализированы результаты ПЭМ для термической обработки капсидов норовируса человека. Здесь капсиды обрабатывались при температуре от 60 до 80 градусов Цельсия слева направо.

Как можно видеть, морфология капсидов явно меняется при обработке по мере того, как капсиды агрегируются и денатурируются. Аналогичное явление отмечается для капсидов, обработанных при температуре 68 градусов Цельсия в течение нуля-25 минут. После освоения эти техники можно выполнять от одного до 24 часов, если они выполняются правильно.

После своего развития этот метод предоставил исследователям в области пищевой вирусологии дополнительные возможности для изучения механизмов и эффектов инактивации капсида норовирусов человека. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ОТ-ПЦР в реальном времени с предварительной обработкой РНКазы и без нее, страница STS вирусных капсидов и анализ бляшек с культивируемыми суррогатными вирусами, чтобы получить более полное общее представление о снижении вирусности после данного лечения. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать связывание лигандов, динамическое рассеяние света и просвечивающую электронную микроскопию для получения дальнейшего механистического представления о влиянии инактивационной терапии на капсид норовируса человека.

Не забывайте, что работа с некоторыми из используемых реагентов может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты и следование передовым методам безопасности в лаборатории.