Удобный метод для извлечения и анализа с высокого давления жидкостной хроматографии и их метаболитов катехоламинов нейротрансмиттеров

Общая цель этой процедуры заключается в одновременном определении трех моноаминовых нейротрансмиттеров и двух их метаболитов в моче младенца с помощью удобной твердофазной экстракции в сочетании с жидкостной хроматографией высокого давления с электрохимическим детектированием. Этот метод позволяет прогнозировать и определять нестабильные целевые соединения в готовом образце с простотой эксплуатации за короткое время. Ваши примеры могут быть легко предварительно очищены с помощью узкого кворума с твердой поверхностью, упакованного волокнами, а аналиты в образце могут быть легко обогащены, растворены и обнаружены с помощью электрохимической системы обнаружения.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы поняли, что экстракция и анализ нейротрансмиттеров катехоламинов в биологических жидкостях имеют решающее значение для оценки резистентной функции и связанных с ней заболеваний. Люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что необходимо избегать воздействия света, а время предварительной обработки должно быть как можно короче. Для демонстрации процедуры у нас есть Ланлань Вэй и Цин Хань, два аспиранта из нашей лаборатории.

Для начала приготовьте два миллиграмма на миллилитр исходного раствора раствора DPBA, растворив два миллиграмма соединения в одном миллилитре дистиллированной воды. Храните раствор в темноте при температуре четыре градуса Цельсия. При приготовлении разлителей аналита учитывайте, что химическая структура и свойства катехоламинов нестабильны, а так как они легко разлагаются, процесс приготовления наполнителей должен быть очень быстрым, а также следует избегать воздействия тонких солнечных лучей.

Свесьте 1,0 миллиграмма норадреналина, адреналина, дофамина, MHPG, DOPAC и внутреннего стандарта DHBA в отдельных микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитров. Добавьте 1,0 миллилитра дистиллированной воды для растворения каждого из соединений, кроме адреналина, который следует растворить в 0,01-молях-литрах раствора соляной кислоты. Осциллируйте подготовленные стандарты в темноте с высокой скоростью до полного растворения аналитов.

Это первичные запасы, и они могут храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия до нескольких недель. Чтобы получить запасы вторичного аналита норадреналина, эпинефрина, дофамина, DOPAC и MHPG, переведите по пять микролитров каждого первичного аналита в 4 975 микролитров дистиллированной воды в отдельных пятимиллилитровых центрифужных пробирках. Готовьте эти растворы свежими ежедневно и храните их в темноте при температуре четыре градуса Цельсия до использования.

Для DHBA перелейте пять микролитров первичного сырья в 4 995 микролитров дистиллированной воды в пятимиллилитровую центрифужную пробирку и храните ее отдельно в темноте при температуре четыре градуса Цельсия. Выполните дальнейшие разбавления с помощью вторичного аналитного материала, чтобы создать стандартную кривую. Храните растворы в темноте при температуре четыре градуса Цельсия и ежедневно готовьте свежие.

Далее протестируйте оптимальное напряжение ECD-детектора, используя стандартный запас с нужной концентрацией. Изменяйте напряжение, чтобы найти значение, при котором аналиты имеют наилучший пиковый вид. Для приготовления 10 миллилитров элюентового растворителя используйте 5,5 миллилитров дистиллированной воды, затем по капле добавляйте в воду 1,5 миллилитра ацетонитрила и три миллилитра фосфорной кислоты.

Чтобы подготовить подвижную фазу, отмерьте перечисленные в текстовом протоколе компоненты в чистую литровую бутылку. Добавьте 40 миллилитров ацетонитрила и дистиллированную воду до 1 000 миллилитров. Перемешивайте и вибрируйте ультразвуком в течение 15 минут, пока вещество в растворе полностью не растворится.

С помощью рН-метра со стеклянным электродом отрегулируйте значение рН подвижной фазы до 4,21 с помощью насыщенного раствора гидроксида натрия. Отфильтруйте подвижную фазу с помощью микропористой мембраны из поливинилиденфторида толщиной 0,45 микрона и вакуумного всасывающего устройства для удаления загрязнений. Используйте ультразвуковую вибрацию в течение 15 минут для дегазации подвижной фазы каждый раз перед использованием.

мочи в вихревую обработку и центрифугируйте их при давлении в 1,510 раз по G в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы удалить большую часть интерференции твердых частиц. Соберите надосадочную жидкость, а осадок выбросьте для дальнейших экспериментов. Для эффективного извлечения аналитов сразу после центрифугирования приступайте к твердофазной экстракции упакованным волокнам или предварительной обработке PFSPE.

Чтобы активировать нановолокна, 100 микролитров метанола и 100 микролитров воды последовательно протолкните через колонку PFSPE с помощью пятимиллилитрового шприца в медленном порядке по капле. Образец мочи необходимо смешать с раствором DPPA, чтобы улучшить его гидрофобность и помочь катехоламинам и метаболитам впитаться в волокна. Решение DHBA также должно быть добавлено в качестве внутреннего стандарта.

Смешайте 100 микролитров образца мочи со 100 микролитрами двух миллиграммов на миллилитр раствора DPBA и 30 микролитров 100 нанограммов на миллилитр внутреннего стандартного раствора DHBA в 0,5-миллилитровой пробирке Eppendorf. Затем продавливают раствор смешанного образца через колонку PFSPE с помощью пятимиллилитрового пластикового шприца газового типа, используя силу давления воздуха. Трижды промыть колонку с помощью пятимиллилитрового газового пластикового шприца для загрузки 100 микролитров раствора DPBA в колонку SPE и медленно протолкнуть раствор через картридж под давлением воздуха.

Этот этап промывки необходим, потому что раствор DPBA может удалять загрязнения, сохраняя при этом аналиты, тем самым повышая чувствительность и селективность аналитов. Затем загрузите 50 микролитров элюента в колонку PFSPE и протолкните его через колонку, собирая элюат с помощью 0,5-миллилитровой трубки Эппендорфа. Включите дегазатор ВЭЖХ, чтобы дегазировать воздух в системе.

Перед анализом образцов система должна работать более 0,5 часов с подвижной фазой, чтобы уравновесить и снизить исходный уровень шума. Отберите 20 микролитров элюата с помощью автоматического пробоотборника, а затем введите его в систему ECD для ВЭЖХ. Когда прогоны будут завершены, выключите ячейку детектора с помощью интерфейса детектора.

Не выключайте ячейку с помощью переключателя в задней части детектора, так как это может повредить прибор. Вручную измените состав подвижной фазы на 10% метанола и 90% воды. Проработав не менее 30 минут, вручную измените подвижную фазу на метанол класса ВЭЖХ.

Запустите систему примерно на 15 минут, чтобы защитить ее в метаноле. Если не выполнить этот шаг с соблюдением рекомендованного времени выполнения, это может привести к повреждению колонки и детектора. Выключите поток, а затем выключите дегазатор.

Приступайте к анализу катехоламинов, как описано в текстовом протоколе. Хроматограмма образца воды с шипами с мишенями и внутренним эталоном показана без экстракции. При условии ВЭЖХ в протоколе пять целевых пиков метода PFSPE хорошо разделены и значительно выше, чем те, которые экстрагируются коммерческим картриджем с фенилбороновой кислотой.

Кроме того, пик DOPAC не отображался в результате экстракции картриджа PBA, что указывает на то, что колонка PBA не способна извлекать DOPAC. Когда образец мочи был извлечен, метод PFSPE мог не только извлечь мишени с хорошей идентификацией пиков, но и избавиться от большей части помех в моче. Калибровочные кривые были построены для каждого соединения путем построения коэффициента площади пика, показывающего хорошую линейность при низкой концентрации.

Для валидации с помощью реальных образцов мочи были протестированы образцы мочи 28 младенцев из группы высокого риска и 22 здоровых младенцев. В то время как некоторые катехоламины существенно не различались между группами высокого риска и здоровыми группами, у младенцев с высоким риском было больше метаболита MHPG, чем в контрольной группе. Таким образом, уровень MHPG в моче может быть потенциальным маркером для раннего выявления младенцев с высоким риском.

После освоения этой техники ее можно сделать за считанные минуты. Пытаясь провести процедуру, важно не забывать готовить пепел свежим, быстро работать и не допускать воздействия прямых солнечных лучей. Добавление раствора дифенилбората кислоты на этапах абсорбции и промывки также имеет решающее значение.

После этой процедуры, как измеряется отсутствие терминации катехоламинов и метаболитов в плазме или спинномозговой жидкости. Метод Alsliver может быть выполнен для того, чтобы определить универсальность этого протокола при тестировании других биологических жидкостей. После своего развития этот метод проложил путь исследователям к изучению взаимосвязи между дефицитом развития нервной системы и уровнем катехоламинов в моче в детских образцах.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как выполнять метод твердофазной экстракции с помощью фигур nair и простого устройства, PCE PS fibules corporate waste, DPBA может помочь очистить катехоламиновые нейротрансмиттеры в образцах мочи. Этот метод распространяется на раннюю диагностику черной смородины с риском повреждения головного мозга у младенцев. Потому что сравнительный анализ выявил аномальные различия в унарных MHPG у детей с аутизмом, что указывает на то, что метаболиты катехоламина могут быть важным кандидатом в маркеры.