Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

Общая цель этого метода заключается в количественной оценке локализации и распределения клеток-предшественников сердца в процессе органогенеза сердца. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития сердца, позволяя нам наблюдать за локализацией популяций сердечных предшественников во время нормального эмбрионального развития. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что объемные изображения могут дать количественную информацию о динамике уровня тканей, а также в том, что конвейер анализа может быть автоматизирован для улучшения воспроизводимости.

Хотя этот метод дает информацию о раннем сердечном органогенезе, он также может быть применен к общему изучению раннего эмбриогенеза или к морфогенезу других органов, представляющих интерес. Утром восьмого дня эмбриона продезинфицируйте брюшную полость беременной мыши с помощью этанола 70% и сделайте надрез брюшной полости через кожу и стенки тела. Начиная выше одного яйцевода, тщательно рассекайте жир по бокам матки вниз до шейки матки.

Сделайте разрез через шейку матки и продолжайте до верхнего конца другого разреза яйцевода, чтобы освободить всю матку. Смойте излишки крови из матки в 10-сантиметровой посуде, содержащей свежую PBS, и разрежьте мезометрий между каждым децидуомом. Перенесите эмбрионы в шестисантиметровую чашку, содержащую свежий PBS, под препарирующим микроскопом и с помощью тонких щипцов номер пять для удаления ткани матки из децидуальной ткани.

Затем осторожно разрежьте кончик эмбриональной половины децидуом, чтобы выявить эмбрионы, защипывая децидуом, чтобы осторожно вытолкнуть и вытащить первый эмбрион. Удалите как можно больше лишней эмбриональной ткани без повреждения морфологии животного и с помощью пипетки для переноса поместите эмбрион в пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую свежий PBS на льду. Когда все эмбрионы будут собраны, отсадите PBS из каждой пробирки и промойте эмбрионы свежими PBS.

После тщательной аспирации PBS из каждой пробирки зафиксируйте эмбрионы в 4% параформальдегиде в течение одного часа при комнатной температуре, после чего последует три промывки свежим PBS, затем храните эмбрионы при температуре четыре градуса Цельсия. Начните с замены PBS на один миллилитр блокирующего буфера для четырехчасовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации замените блокирующий буфер соответствующей смесью первичных антител и разведенным блокирующим буфером для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия.

На следующее утро аспирируйте избыток антител и промойте эмбрионы три раза в течение одного часа за одну промывку в 0,1% тритоне в PBS. После третьего промывки добавьте соответствующую смесь вторичных антител к эмбрионам для трехчасовой инкубации при комнатной температуре, после чего последует три промывки, как показано только что. Затем запятнайте эмбрионы DAPI в PBS в течение 10 минут, после чего последует два пятиминутных промывания, затем медленно суспензируйте эмбрионы в монтажной среде, препятствующей выцветанию, позволяя эмбрионам уравновеситься в течение как минимум одного часа, с периодическими легкими перелистываниями, чтобы помочь образцам опуститься в раствор.

Перед установкой эмбрионов сделайте две параллельные стопки из пяти-шести слоев двойной клейкой ленты на расстоянии от 15 до 20 миллиметров друг от друга на одном предметном стекле микроскопа для каждого эмбриона и нанесите каплю 15 микролитров среды, препятствующей выцветанию, на каждое предметное стекло между стопками ленты. Осторожно перенесите по одному эмбриону в каждую каплю и с помощью диссекционного микроскопа и тонких щипцов расположите эмбрионы так, чтобы их передняя сторона была обращена в сторону от предметного стекла, а ось их тела находилась на одной линии с длинной осью предметных стекол. Чтобы разместить покровные стекла, сначала положите одну сторону стекла на одну стопку двойной клейкой ленты и с помощью щипцов осторожно опустите покровную крышку, пока она не соприкоснется с другой стопкой ленты.

Особенно важно тщательно расположить и посадить эмбрионы. Эмбрионы, которые расположены неправильно, будет гораздо сложнее визуализировать и могут потребовать дополнительной обработки для получения хороших количественных данных. С помощью пипетки добавьте дополнительную защитную среду между предметным стеклом и покровным стеклом, чтобы предотвратить высыхание образца во время визуализации, и выберите объектив с максимальным увеличением, который позволяет захватывать всю область сердечного полумесяца в одном поле зрения.

Затем настройте параметры визуализации, используя стандартные передовые методы визуализации, и используйте частоту выборки Найквиста для определения размеров вокселя XYZ каждого эмбриона. Чтобы проанализировать изображения эмбрионов, загрузите наборы необработанных данных изображений в соответствующее программное обеспечение для анализа изображений и откройте первый файл в режиме предварительного просмотра. Данные будут загружены в 3D-виде в режиме проекции максимальной интенсивности.

Откройте окно настройки отображения и выберите только опорный канал. При необходимости отрегулируйте порог изображения. Если отношение сигнал/шум слишком низкое для сегментации, отрегулируйте гамму.

Следование передовым методам получения изображений имеет решающее значение для получения подходящих данных и будет зависеть от конкретной используемой микроскопии. Если требуется корректировка гаммы, эти изображения не следует использовать для сравнения интенсивностей флуоресценции. Используйте диалоговое окно алгоритма обработки поверхностей для создания новой поверхности для опорного канала и установите флажок Начало интереса только для сегмента.

Настройте область ограничивающей рамки так, чтобы она содержала интересующую область, очерченную опорным пятном, и выберите опорный канал из раскрывающегося меню исходного канала. Установите сглаживание на половину размера воксела Z и с помощью ползунков порога отрегулируйте нижний предел до его абсолютной интенсивности, чтобы поверхность не выходила за пределы сигнала канала. Отфильтруйте объекты по количеству вокселов или объему, отбросив все фоновые объекты, которые могли быть сгенерированы алгоритмом, и завершите работу алгоритма.

Затем выберите только что созданную поверхность и выберите функцию набора масок в окне редактирования. Выберите интересующий экспериментальный канал, следя за тем, чтобы был установлен флажок «Дубликат канала перед применением маски», и выберите канал маски только в окне настройки отображения. Затем создайте новую поверхность, как показано на рисунке.

Чтобы получить объемные данные с каждой выбранной поверхностью, откройте подвкладку сведений на вкладке статистики и выберите средние значения из выпадающего меню. Общий объем поверхности будет найден в столбце суммы сгенерированной таблицы. Здесь показан эмбриональный эмбрион мыши на 8,25-й день с GFP-положительными желудочковыми сердечно-сосудистыми прогениторными клетками, меченными антителом против сердечного полумесяца, как только что было показано.

После выбора опорного канала для окрашенной ткани интенсивность и гамма корректируются перед началом алгоритма создания поверхностей. Выбирается область интереса и уровень детализации поверхности. Начальная поверхность имеет пороговое значение, чтобы включить в себя все истинные сигналы на поверхности.

Затем выполняется фильтрация для удаления мелких фрагментов фона для получения окончательной поверхности отсчета. Выбрав опорную поверхность, можно дублировать и замаскировать канал сравнения. Интенсивность и гамма для этого канала регулируются перед генерацией второй поверхности с помощью той же последовательности шагов.

Общий объем для каждой поверхности рассчитывается автоматически и может быть сравнен как количественно, так и визуально. При проведении этой процедуры важно помнить, что качество препарированных эмбрионов, эффективность антител, ориентация монтажа и установка визуализации — все это влияет на качество окончательных данных. В дополнение к этому конвейеру количественного анализа могут быть выполнены другие методы, такие как деконволюция, для получения дополнительных качественных данных.

После своего развития эта технология проложила путь исследователям в области развития сердца к изучению динамики новых популяций сердечных предшественников во время раннего эмбриогенеза.