Использование Dot пробирного анализа миграции клеток листов

Общая цель точечного анализа заключается в оценке миграционного фенотипа прикрепленных сплоченных клеточных листов в ответ на сигналы микросреды. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака, например, как цитокины или факторы роста изменяют подвижность опухолевых клеток. Основное преимущество точечного анализа заключается в том, что он легко выполняется и используется для получения воспроизводимых результатов.

Несмотря на то, что этот метод может дать представление о подвижности клеток, он также подходит для ряда последующих анализов, таких как окрашивание клеток для оценки морфологии роста колонии и рассеяния клеток, иммуноокрашивание, анализ белков и ДНК или РНК или инъекция клеток животным. Для начала разморозьте мышиный коллаген четыре на льду и разбавьте его 50 микромолярами HCL, чтобы приготовить три миллилитра раствора коллагена 10 микрограмм на миллилитр. Добавьте 250 микролитров коллагенового раствора в лунки 12-луночных пластин со стеклянным дном и поместите их в плотно закрывающуюся пластиковую коробку соответствующего размера.

Положите влажное бумажное полотенце на пластины и вокруг них, чтобы создать влажную камеру, и закройте коробку. Затем инкубируйте пластины в течение ночи при комнатной температуре. На следующее утро, чтобы удалить неабсорбированный коллаген и буфер, используйте деионизированную воду для промывки пластин дважды, направляя воду к краю пластины, а не к краю, образованному краевым дном и покровным стеклом.

Высушите пластины на воздухе в колпаке с ламинарным потоком и используйте их сразу или храните при температуре четыре градуса Цельсия до пяти дней. Для приготовления клеточной суспензии используют клетки, выращенные в 60-миллиметровой чашке для культуры тканей в DMEMF12 среде, с добавлением 5% лошадиной сыворотки до 80% конфлюенса. Используйте DPBS, не содержащие кальция и магния, чтобы промыть клетки один раз, затем добавьте 500 микролитров трипсина ЭДТА комнатной температуры и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в 5% CO2 во влажной атмосфере в течение трех-пяти минут.

Суспензируйте отделенные клетки в 4,5 миллилитрах питательной среды, чтобы остановить активность трипсина, и с помощью гемоцитометра отсчитайте 20 микролитров аликвоты клеточной суспензии. Вытащите оставшиеся ячейки в конической пробирке объемом 50 миллилитров путем центрифугирования при 200-кратной гравитации в течение трех минут. Затем аспирируют надосадочную жидкость и повторно суспендируют клетки в культуральной среде в соотношении от трех до 10 до шести клеток на миллилитр.

Чтобы нанести покрытие клеток в центр каждого покровного стекла коллагеновой 12-луночной стеклянной нижней пластины с четырехслойным покрытием, поместите каплю клеточной суспензии объемом 10 микролитров, стараясь не касаться и не царапать покрытие. Покрытие некруглой капли не даст круглого листа ячеек, а если к покрытию прикоснуться или поцарапать, это помешает ячейкам хорошо прилипнуть. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере в течение 30 минут, чтобы клетки могли прикрепиться.

Затем проверьте наличие крепления под перевернутым микроскопом. Одним миллилитром питательной среды дважды аккуратно промойте лунки, чтобы удалить неприкрепленные клетки, затем добавьте по одному миллилитру питательной среды в каждую лунку. Проверьте под перевернутым микроскопом, чтобы не осталось плавающих ячеек, в противном случае промойте лунки еще раз.

Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 во влажной атмосфере, чтобы получить четко очерченные клеточные листы. С помощью инвертированного микроскопа проверьте все лунки, чтобы убедиться, что клеточные колонии выросли правильно. При необходимости отметьте неподходящие лунки и не используйте их.

Промаркируйте каждую лунку планшета соответствующим образом для каждого исследуемого состояния. Выполните каждое условие в двух или трех экземплярах. Измените среду, чтобы лишить клетки DMEMF12, содержащей 0,1% лошадиной сыворотки, за три часа до стимуляции клеток.

Затем стимулируйте клетки, добавляя EGF или другие желаемые медиаторы. Используйте пипетку объемом в один микролитр или аккуратно взболтайте пластину, чтобы перемешать среду. Инкубируйте планшет от одного до четырех дней, чтобы наблюдать за смещением края и контуром края.

Чтобы провести окрашивание H и E, дважды промойте ячейки PBS и зафиксируйте их примерно на две минуты. Добавляйте гематоксилин примерно на две минуты, чтобы окрашивать ядра. Промойте клетки водопроводной водой в течение пяти-10 минут, пока ядра не станут синими.

Затем окрашивайте цитоплазму эозином в течение двух минут, прежде чем промыть клетки деионизированной водой. Высушите пластину на воздухе, затем переверните ее и с помощью линейки измерьте диаметр точки. В качестве альтернативы можно сделать снимки пластины с помощью камеры и использовать ImageJ для анализа диаметра точки.

Чтобы провести покадровую микроскопию, включите микроскоп инкубатора и отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию. Наполните увлажнитель DH2O, затем отрегулируйте CO2 до 5%.Убедитесь, что камера инкубатора увлажнена, а моторизованная сцена может свободно двигаться. Затем закройте камеру инкубатора и дайте микроскопу отрегулироваться до 37 градусов Цельсия.

Поместите планшет на столик микроскопа инкубатора и настройте список стадий, затем сфотографируйте два противоположных края и центр каждой точки клетки. Используя объектив 10X, делайте снимки каждые три минуты в течение 15–24 часов. Загрузите данные и приступите к анализу изображений в выбранной программе, такой как Matlab.

Первоначально фазово-контрастная визуализация клеточных точек показала, что инвазивные клетки рака молочной железы, образующие колонии легких, сохраняют мезенхимальный фенотип после стимуляции EGF. Тем не менее, одиночные клетки, покидающие лист, чаще наблюдаются в EGF-стимулированных точках клеток. Реакцию колониеобразующих клеток рака молочной железы легких на EGF дополнительно оценивали с помощью H и E окрашивания культур, которые стимулировали EGF в течение четырех дней.

Действительно, стимуляция EGF привела к увеличению диаметра колонии, что указывает на то, что миграция клеток, стимулированных EGF, может быть изменена. В этом точечном анализе клетки по краям листа визуализировались в течение девяти часов после стимуляции колониеобразующих клеток рака молочной железы с помощью EGF. PIV показал, что EGF увеличивает скорость клеток до 0,63 микрометра в минуту с 0,45 микрометра в минуту в контрольных клетках.

Кроме того, EGF снижал вариабельность направленности клеток, или углового распространения, с 0,95 в контрольных культурах до 0,79 в культурах, стимулированных EGF. Кроме того, как было замечено при окрашивании H и E через четыре дня, EGF увеличил радиальное смещение края эпителия в течение девяти часов, с 257 микрометров до 356 микрометров. После освоения этой техники время на практическое освоение составляет пару часов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как покадровая визуализация, иммуноокрашивание и анализ ДНК и РНК, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Например, его можно использовать для анализа дифференциальной экспрессии белков в быстро или медленно мигрирующих клетках, или когда клетки мигрируют в окружающую среду. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как настроить точечный анализ и использовать его для оценки миграционного фенотипа прикрепленных сплоченных клеточных листов в ответ на микроэнветронемнтальные сигналы.