Простой подход к побудить Экспериментальный аутоиммунный неврит мышей C57BL/6 для оценки функциональных и патологического
9 ноября 2017 г.
В настоящем докладе излагается простой подход к успешно побудить экспериментальной аутоиммунных неврит (EAN) с использованием миелиновый белок ноль (P0)180-199 пептида в сочетании с полного адъюванта Фройнд и коклюша токсин. Мы представляем современные парадигмы способны точно оценить степень функциональной дефицита и невропатологии, которые происходят в этом EAN.
Общая цель этой процедуры заключается в успешном индуцировании экспериментального аутоиммунного неврита или ЭАН в мышиной модели для функционального и патологического анализа патологического процесса. Модель EAN может быть использована для решения ключевых вопросов, связанных с периферической нейропатией. Это также прекрасная модель для потенциального исследования эффективности новых терапевтических агентов.
Основное преимущество этого подхода заключается в том, что он обеспечивает простую и объективную парадигму функционального тестирования, которая может быть применена при использовании модели EAN на мыши. Сегодня вместе со мной эту процедуру демонстрирует Санг Вон Ю, студент бакалавриата в лаборатории биологии нейротрофина и миелина в Мельбурнском университете. За три дня до индукции заболевания включите аппарат для оценки двигательных функций и включите световую кнопку.
Возьмите мышку в руки и опустите ее на емкость с красным пищевым красителем. Поместите мышь в прогулочный отсек и установите скорость беговой дорожки на 15 сантиметров в секунду. Включите беговую дорожку и нажмите кнопку «Запись», чтобы использовать систему визуализации функции ходьбы для фиксации беговых движений мыши в течение 36 секунд.
Через 36 секунд остановите запись и беговую дорожку и сохраните видеофайл тренировочного забега в указанную папку. За день до первой иммунизации с помощью шприца объемом 0,5 миллилитра, оснащенного иглой калибра 30-1/2, введите 1,6 микрограмма на миллилитр коклюшного токсина в 250 микролитрах изотонического PBS IP-мышей мышей, находящихся под наркозом от шести до восьми недель. Затем оцените мышей по клиническим признакам EAN по шкале от нуля до четырех в соответствии с таблицей и выполните оценку двигательной функции, как показано только что на рисунке.
На следующий день соедините равные объемы свежеприготовленных растворов пептида в 0,9%-ном физиологическом растворе и 20 мг на миллилитр микобактерии туберкулеза в полном адъюванте Фрейнда в бусинной бусине и перемешайте растворы на максимальной скорости в течение одной минуты при комнатной температуре. Загрузите инокулюм в шприц, оснащенный иглой 23 калибра, переверните и встряхните шприц перед тем, как выпустить воздух из шахты шприца. Перед введением инокулята удалите волосы сбоку от средней линии между лопатками и продезинфицируйте открытые участки кожи 70% этанолом.
Затем с помощью щипцов Адсона захватите кожу и подайте 50 микролитров раствора мыши, введенной коклюшным токсином, путем подкожной инъекции. На следующее утро введите 1,2 микрограмма на миллилитр коклюшного токсина в 250 микролитрах PBS IP, как только что было продемонстрировано, а затем еще 1,2 микрограмма на миллилитр коклюшного токсина IP через 48 часов. Через три дня после третьей инъекции коклюша введите еще 50 микролитров свежеприготовленного инокулюма в то же место инъекции, что и раньше, и контролируйте клинический результат и двигательную функцию животных два раза в неделю до конца эксперимента.
Пептид-индуцированная пептидами P0 180-199 EAN у мышей C57BL/6 приводит к монофазному заболеванию с клиническим началом через шесть дней после первой иммунизации и максимальной тяжестью через 25 дней после первой иммунизации, с последующим некоторым улучшением клинической оценки через 40 дней после первой иммунизации. Мыши начинают терпеть неудачу в выполнении простой задачи по бегу уже через шесть дней после первой иммунизации, при этом к 35 дню после иммунизации способность бегать на беговой дорожке не улучшается, а через 55 дней после первой иммунизации способность к бегу не улучшается. Исследование полутонких участков седалищных нервов у мышей, индуцированных пептидами EAN, выявило участки демиелинизации по сравнению с седалищными нервами у здоровых людей того же возраста.
Изображения с помощью просвечивающей электронной микроскопии высокой мощности позволяют идентифицировать специфические невропатологические особенности, такие как демиелинизация, повреждение миелиновой пластинки и признаки стресса аксонов, такие как набухание митохондрий. У этих животных также наблюдается острое повреждение аксонов, о чем свидетельствует травматически повышенная экспрессия белка-предшественника бета-амилоида в седалищных нервах, которая не наблюдается в здоровых контрольных тканях соответствующего возраста. Также наблюдается расширение узлов и разрушение параузлов.
После освоения подкожные инъекции могут быть выполнены в течение примерно 5-10 минут для каждой мыши с минимальной вероятностью какой-либо ошибки при инъекции. При попытке выполнить эту процедуру очень важно, чтобы вы наблюдали за местом инъекции, чтобы убедиться, что весь инокулюм остается в месте инъекции и что он не вытекает. Видеосъемка походки на беговой дорожке отлично подходит, потому что она позволяет рассчитать другие параметры, такие как фаза раскачивания или длина шага, и эти показатели могут стать важными при тестировании эффективности новых методов лечения.
После просмотра этого видео у вас должно быть действительно хорошее понимание того, как индуцировать EAN у самцов мышей C57BL/6. Кроме того, у вас должно быть действительно хорошее понимание того, как безопасно и действительно точно делать подкожные инъекции, гарантируя, что не будет ошибок при введении. Не забывайте, что при работе с иглами и инокулюмом, есть вероятность получения травмы, особенно при использовании острых предметов.
Таким образом, чтобы избежать любой вероятности травмы, действительно хорошей идеей будет всегда использовать щипцы и никогда не захватывать кожу или ткань рукой, а также использовать одноразовые шприцы, никогда не закрывая крышку в процессе.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлена методика индуцирования экспериментального аутоиммунного нейрита (ЭАН) на мышиной модели с использованием пептида 180-199 белка нулевого миелина (P0) в сочетании с полным адъювантом Фрейнда и коклюшным токсином. Целью работы является обеспечение возможности функционального и патологического анализа периферической нейропатии для изучения механизмов развития заболевания и поиска потенциальных методов лечения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Аутоиммунные заболевания
- Периферическая нейропатия
Теоретические основы
- Экспериментальный аутоиммунный неврит (ЭАН) представляет собой модель для изучения периферической нейропатии.
- Данная модель удобна для оценки новых терапевтических средств.
- Функциональное тестирование в ходе исследования способствует объективной оценке.
- Ключевые поведенческие показатели включают двигательную функцию и клиническую оценку по балльной шкале.
Цель исследования
- Для эффективного индуцирования ЭАН у мышей линии C57BL/6 в исследовательских целях.
- Для анализа степени функционального дефицита и нейропатологии.
- Для разработки воспроизводимого протокола для будущих исследований периферической нейропатии.
Используемые методы
- Платформа предполагает использование беговой дорожки и системы визуализации функции походки для функциональной оценки.
- В данной модели для процесса индукции EAN используются самцы мышей C57BL/6.
- В исследовании не упоминались мультиомиксные рабочие процессы.
- Протокол включает различные подкожные инъекции через определенные интервалы времени после иммунизации.
- Оценка моторной функции проводится многократно в течение исследования для мониторинга прогрессирования заболевания.
Основные результаты
- Исследование подтверждает монофазное течение заболевания с пиком клинических симптомов на 25-й день после иммунизации.
- Значительное снижение функциональных показателей при выполнении двигательных задач наблюдается с шестого по 35-й день.
- Нейропатологический анализ демонстрирует демиелинизацию и аксональное повреждение у подопытных мышей по сравнению с контрольной группой.
- Повышенная экспрессия белка-предшественника бета-амилоида указывает на острое повреждение аксонов.
Выводы
- Данное исследование представляет четкий и эффективный протокол индуцирования ЭАН, способствующий пониманию нейропатологии.
- Сведения о процессах развития заболевания служат основой для будущих исследований потенциальных методов лечения периферической нейропатии.
- Эти результаты расширяют понимание аутоиммунных механизмов, воздействующих на периферическую нервную систему.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Данный протокол позволяет индуцировать экспериментальный аутоиммунный неврит у мышей линии C57BL/6, для которой доступен широкий спектр генетических инструментов, что способствует снижению рисков при механистическом обосновании терапевтических кандидатов, направленных на борьбу с периферической демиелинизацией. Модель обеспечивает количественную функциональную и нейропатологическую оценку, что повышает прогностическую достоверность при доклиническом исследовании стратегий восстановления миелина и нейропротекции. Воспроизводимость данной модели и ее совместимость с трансгенными подходами делают ее трансляционным инструментом для валидации мишеней в исследованиях аутоиммунной периферической нейропатии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать патогенные механизмы аутоиммунной периферической нейропатии посредством индуцибельной, пептид-зависимой иммунной активации у генетически модифицируемого хозяина.
- Практическая ценность: использование линии C57BL/6 позволяет интегрировать метод с нокаутомными, нок-ин и репортерными моделями для снижения рисков при определении причинных мишеней.
- Прогностическая ценность: обеспечивает проверку гипотез о путях иммуноопосредованного повреждения нервов, помогая в принятии ранних решений о целесообразности дальнейшей разработки иммуномодулирующих или ремиелинизирующих препаратов.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Позволяет количественно оценить функциональное снижение за счет анализа походки на беговой дорожке, что делает возможным лонгитюдный мониторинг двигательного дефицита в качестве фармакодинамического биомаркера.
- Практическая ценность: Стандартизированная клиническая оценка (по шкале 0–4) и определенные по времени интервалы иммунизации обеспечивают воспроизводимое индуцирование заболевания в разных когортах исследования.
- Готовность анализа: Совместимость со слепым нейропатологическим исследованием, включая изготовление полутонких срезов и электронную микроскопию, для подтверждения воздействия нейропротекторных соединений на мишень.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Воспроизводит основные нейропатологические признаки периферической демиелинизации у человека, включая повреждение аксонов, подтвержденное повышенным уровнем белка-предшественника бета-амилоида, что обосновывает механистическую релевантность.
- Трансляционная преемственность: Позволяет оценивать терапевтических кандидатов на различных стадиях заболевания — от начала (день 6) до пика (день 25) и восстановления (день 40), что способствует оптимизации дозировки и сроков введения.
- Продвижение с учетом рисков: Облегчает оценку эффективности восстановления миелина и нейропротекции, снижая биологическую неопределенность перед проведением исследований для подачи заявки на регистрацию нового лекарственного препарата (IND).
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод встраивается в континуум открытий — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до преклинических испытаний эффективности, особенно для биологических препаратов или малых молекул, предназначенных для модуляции аутоиммунных реакций или поддержания целостности аксонов при периферической нейропатии.
- Поисковая биология: способствует снижению механистических рисков за счет возможности контролируемой индукции аутоиммунитета, специфичного для ПНС, для валидации мишеней, участвующих в иммунном взаимодействии с нервами.
- Скрининг: предоставляет стандартизированную платформу для оценки влияния соединений на двигательную функцию и нейропатологию с результатами, подходящими для высококонтентного имиджинга и скоринга.
- Аналитика: позволяет получать лонгитюдные функциональные данные (параметры походки, длина шага, фаза переноса) и конечные гистопатологические показатели для сравнительного анализа между группами лечения.
- Трансляционные исследования: соответствует требованиям доклинической валидации путем моделирования хронически-ремитирующих признаков и аксональной патологии, характерных для периферических нейропатий у человека.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую иммунологическую и нейробиологическую платформу для итерационного тестирования терапевтических гипотез в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: снижает механистическую неопределенность в моделях периферической нейропатии за счет обеспечения точного и воспроизводимого индуцирования иммуноопосредованной демиелинизации и аксонального стресса.
- Операционная ценность: четко определенный график иммунизации и бустинга в сочетании со стандартизированным функциональным тестированием повышает воспроизводимость между лабораториями и снижает вариабельность.
- Стратегическая ценность: повышает уверенность при принятии решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя ранние количественные доказательства модуляции мишени в релевантной системе заболевания.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию кандидатов с учетом рисков, демонстрирующих эффекты как на функциональные результаты, так и на нейропатологические конечные точки.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с мышами, владение методами подкожного введения препаратов и проведения перфузионной фиксации для нейропатологического анализа.
- Необходим доступ к системам визуализации походки на беговой дорожке, а также к оборудованию для получения полутонких срезов и электронной микроскопии.
- Требуется стандартизированное обучение методам клинической оценки и проведению слепого анализа для обеспечения согласованности данных, полученных разными операторами.
- При экстраполяции метода на другие линии мышей может потребоваться корректировка концентрации пептида и состава адъюванта в связи с вариабельностью иммунного ответа.
- Метод ограничен монофазным течением заболевания; без модификации протокола он может не моделировать рецидивирующе-ремитирующие или хронически прогрессирующие формы периферической нейропатии.
