Биотинилированным клеток-проникая пептиды для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий

Общей целью данной процедуры является изучение белок-белковых взаимодействий во внутриклеточном контексте. Это достигается за счет системы вытягивания биотин-авидин в сочетании с самопроникающими последовательностями, что позволяет проводить инкубацию в целевой последовательности с живыми клетками. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной сигнализации, такие как быстрое и динамичное взаимодействие между биомолекулами для получения определенных сигналов.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что молекулярные взаимодействия происходят во внутриклеточном контексте. В этом исследовании были помещены стволовые клетки глиомы человека G166 или ГСК в четыре колбы площадью 150 квадратных сантиметров, как описано в текстовом протоколе. Обработайте клетки при достижении слияния.

Когда пять миллионов элементов G166 помещаются в колбу площадью 150 квадратных сантиметров, они обрабатываются через два дня после покрытия. Вращайте флаконы, содержащие лиофилизированные биотинилированные пептиды, проникающие в клетки, в 8 200 раз г в течение 30 секунд, чтобы избежать остатка порошка на крышке. Включите контролируемый BCPP, чтобы убедиться, что обнаруженные взаимодействия специфичны для целевой последовательности.

Затем растворите БЦПП в соответствующей питательной среде до исходного раствора, указанного производителем. Для получения исходного раствора в концентрации два миллиграмма на миллилитр BCPP для лечения GSC добавьте 0,5 миллилитра питательной среды GSC в один флакон, содержащий один миллиграмм BCPP. Закрутите флаконы и убедитесь, что пептид хорошо растворился.

Подготовьте не менее 12 пробирок объемом 1,5 миллилитра для каждого условия в проводимом анализе с понижающим давлением. Отметьте первые три пробирки по условиям. Они будут иметь общий объем клеточных лизатов.

Затем отметьте буквой «А» на трех пробирках для каждого условия. В этих пробирках будут первые надосадочные жидкости, полученные после лизиса и вращения клеточных лизатов. Затем отметьте буквой B на трех пробирках для каждого условия.

Эти пробирки будут иметь небольшую аликвоту первых надосадочных пластов для образцов вестерн-блоттинга. Наконец, отметьте буквой C на трех трубках для каждого условия. В этих пробирках будут находиться надосадочная жидкость, полученная после вытягивания с помощью NeutrAvidin.

После аспирации питательной среды из клеток замените ее соответствующим объемом свежей среды, необходимым для инкубации БКП в минимально возможном объеме среды в соответствии со временем инкубации. Очень важно, чтобы в любом случае среда полностью покрывала всю поверхность колбы. Добавьте объем стокового раствора БКФЗ к культурам клеток, чтобы достичь концентрации, эффективность которой была доказана.

Поэтому добавьте 92,8 микролитра двух миллиграмм на миллилитр ТАТ-коннексина 43, 266-283 биотина на миллилитр питательной среды. Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на 30 минут, чтобы убедиться, что взаимодействие между BCPP и его внутриклеточными партнерами происходит. Чтобы выполнить экстракцию белка, сначала полностью аспирируйте питательную среду, затем очень осторожно промойте клетки 10 миллилитрами ледяного фосфатного буферного раствора на 150 сантиметров, чтобы избежать самоотслоения.

Чтобы получить лизат клеток, добавьте три миллилитра буфера для лизиса на колбу площадью 150 квадратных сантиметров и тщательно соскребите поверхность с помощью скребка для клеток. Наклон колбы примерно на 45 градусов облегчит сбор лизатов клеток в соответствующие пробирки. Налейте один миллилитр клеточного лизата на пробирку в три пробирки по 1,5 миллилитра, помеченные для каждого условия.

Для вытягивания центрифугируйте 1,5-миллилитровые пробирки при 11 000 умноженных на g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки с маркировкой А. Перенесите аликвоту надосадочной жидкости по состоянию в другие пробирки с маркировкой В. Затем добавьте 16,6 микролитров буфера 4x Laemmli на 50 микролитров лизата и заморозьте при температуре минус 20 градусов Цельсия. Затем очень хорошо гомогенизируйте агарозу NeutrAvidin путем легкого встряхивания.

Обрежьте кончики наконечников пипеток, чтобы увеличить их диаметр и улучшить пипетирование шариков. Затем добавьте 50 микролитров агарозы NeutrAvidin на миллилитр клеточного лизата в пробирках А. Инкубируйте клеточные лизаты при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи с очень легким встряхиванием, чтобы позволить NeutrAvidin взаимодействовать с BCPP, связанными с их внутриклеточными партнерами.

Затем центрифугируйте при 3000 g в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия, чтобы собрать комплекс нейтроавидина с белками. Осторожно извлеките надосадочную жидкость и переложите ее в чистые пробирки с маркировкой C. Оставьте их для использования на случай, если вытягивание не удастся. Чтобы промыть комплекс NeutrAvidin с белками, добавьте в гранулы А-туб свежий буфер для лизиса.

Повторно суспендируйте гранулу путем инверсии и повторите центрифугирование. Повторите эту стирку еще пять раз. От всех этих надосадочных пластов можно отказаться.

Далее добавьте 40 микролитров 2x буфера Laemmli на 1,5 миллилитровую пробирку для гранул, полученных из 150 квадратных сантиметровых колб сливающихся клеток. Затем выдумывайте при температуре 100 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы диссоциировать взаимодействия между белками. После элюирования центрифугируйте в течение 30 секунд при 8, 200 раз g для гранулирования гранул NeutrAvidin.

Перенесите надосадочную жидкость, содержащую диссоциированные белки с капиллярными наконечниками, в новые пробирки, помеченные D. Теперь эти надосадочные жидкости готовы к загрузке в вестерн-блоттинг, как описано в текстовом протоколе, или могут быть заморожены при температуре минус 20 градусов Цельсия. Здесь представлены иммуноцитохимические изображения, показывающие, что слияние биотина с TAT-коннексином 43 266-283 не изменяет эффекты пептида, проникающего в клетки, на морфологию стволовых клеток глиомы. Анализ МТТ ГСК, обработанных БКПФ или ХТБ, показывает, что слияние биотина с ТАТ-коннексином 43 266-283 не изменяет антипролиферативное действие ТАТ-коннексина 43 266-283 на ГСК.

Здесь показаны репрезентативные результаты вытягивания BCPP с последующим западным блоттингом. Вестерн-блоттинг показывает, что белки, описанные для взаимодействия с TAT, например, Cav-1, появляются в обоих состояниях. Белки, описанные как взаимодействующие с Cx43, например, c-Src и PTEN, появляются сразу после вытягивания TAT-коннексина 43 266-283, в то время как белки, которые напрямую не взаимодействуют с Cx43 или TAT, отсутствуют, например, FAK.

Изображения конфокальной микроскопии подтверждают внутриклеточные взаимодействия, обнаруженные с BCPP. На изображениях показана внутриклеточная колокализация TAT-коннексина 43 266-283 с c-Src вблизи плазматической мембраны в G166 GSCs. После освоения этой техники ее можно выполнить за два дня, если она выполнена правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно подтвердить температуру реагентов и центрифуги, а также слияние клеток перед добавлением пептидов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изучать внутриклеточные белок-белковые взаимодействия с использованием биотинилированных пептидов, проникающих в клетки. После своего развития этот метод открывает путь для исследований в области клеточной сигнализации для изучения внутриклеточных молекулярных механизмов и их специфичных путей в клетках культур, органотипических культурах и даже моделях in vivo.

После этой процедуры другие биологически активные грузы, такие как последовательности РНК, наночастицы, вирусы или другие молекулы, которые могут быть перелиты пептидами, проникающими в клетки, и слиты с тянущими вниз ТАТ, могут быть использованы для изучения их внутриклеточного механизма действия. Несмотря на то, что в этот протокол не включены особо опасные вещества, не забудьте надеть перчатки и лабораторный халат во время выполнения этой процедуры.