Методы для изучения изменений в присущих агрегации белков с возрастом у нематоды Caenorhabditis elegans

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы обнаружить изменения нерастворимости белка с возрастом у C.elegans и оценить, как целевой нокдаун гена влияет на этот маркер старения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области старения и протеостаза, например, почему организмы не могут поддерживать здоровый протеом с возрастом. Основным преимуществом данной методики является возможность изучения агрегации белков при нормальном старении при отсутствии патологических процессов.

Хотя этот метод может дать представление об агрегации белков у C.elegans, он также может быть адаптирован к другим модельным организмам, например, для изучения возрастной нерастворимости белка у мышей. Чтобы начать лечение, добавьте 207,45 мл базальной среды S с дополнительными реагентами, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, в колбу для культуры Фернбаха объемом 2 800 мл. Добавьте конечную концентрацию 50 мкг на миллилитр карбенициллина и один миллимоляр ИПТГ и закройте колбу мембранной завинчивающейся крышкой.

Извлеките L1 из инкубатора с температурой 25 градусов Цельсия и переложите их в 15-миллилитровые пробирки. Центрифугируйте L1 при 1 900 умноженных на g в течение трех минут. После отжима удалите надосадочную жидкость.

Под микроскопом посчитайте L1 на два микролитра и усредните числа, полученные по крайней мере из девяти капель. Затем добавьте 50 000 червей для коллекции молодых червей и 100 000 червей для коллекции выдержанных червей в четыре колбы для культуры Фернбаха, приготовленные на предыдущем этапе. Затем добавьте контрольные РНК-интерференционные бактерии и РНК-интерференционные бактерии для интересующего гена пропорционально количеству червей.

После добавления бактерий завершите культивирование червей S Basal, чтобы довести общий объем до 300 миллилитров. Инкубируйте культуру червей при температуре 25 градусов Цельсия в встряхивающем инкубаторе со скоростью 150 об/мин до сбора. Соберите молодых червей на второй или третий день, чтобы измерить базальные уровни растворимости белка.

Высыпьте червей из одной колбы в разделительную воронку и дайте червям отстояться в течение 10 минут при комнатной температуре. После того как черви осядут, откройте запорный кран и капните червей в одну 50 миллилитровую трубку. Далее разделите гранулу червя на две трубки по 15 миллилитров.

Наполните пробирки до 15 миллилитров М9 и центрифугируйте червей. Чтобы промыть червей, удалите надосадочную жидкость и заполните трубку до 15 миллилитров М9. Повторите центрифугирование. После завершения промывки переложите червей в две 50-миллилитровые трубки и используйте ледяной M9, чтобы заполнить общий объем до 20 миллилитров.

Чтобы удалить бактерии и мертвых червей, добавьте две 20-миллилитровые разбавленные гранулы от червей в две 50-миллилитровые трубки, наполненные 20 миллилитрами ледяной 60% сахарозы. Быстро центрифугируйте пробирки. С помощью пипетки объемом 25 миллилитров осторожно удалите до 15 миллилитров верхнего слоя червя.

Поместите верхний слой червя прямо в 37 миллилитров M9 плюс октоксинол-9, приготовленный на льду. Затем центрифугируйте пробирки при 2 700 умноженных на g в течение трех минут при четырех градусах Цельсия, ускорении девять и замедлении семи. Выбросив надосадочную жидкость, переложите гранулы в четыре 15 миллилитровых тюбиков и дважды промойте их ледяным М9 плюс октоксинол-9.

Затем центрифугируйте пробирки. Снимите надосадочную жидкость и заполните пробирки до отметки 15 миллилитров ледяным М9 плюс октоксинол-9. Промойте червей ледяным М9 и соедините четыре пробирки в две пробирки.

Наполните пробирки до 15 миллилитров и центрифугируйте. Извлеките надосадочную жидкость, заполните две пробирки М9 комнатной температуры до общего объема четыре миллилитра и вращайте их на накидном миксере при температуре 25 градусов Цельсия в течение 40 минут. После нутации дважды промойте червей ледяным М9 плюс октоксинол-9.

Затем дважды промойте их М9 и переложите червей в одну пробирку. Перед сбором червей промойте в буфере для повторной сборки или RAB с высоким содержанием соли без ингибиторов. Удаляйте надосадочную жидкость до тех пор, пока сверху на грануле червя не останется жидкости.

Затем оцените объем гранулы червя и добавьте идентичный объем RAB с ингибиторами. Приготовьте 50-миллилитровую пробирку, наполовину заполненную жидким азотом, на сухом льду и с помощью пастеровской пипетки вытяните червей и медленно капните их в пробирку. Дайте жидкому азоту испариться и храните замороженных червей при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшей обработки.

Охладите ступку жидким азотом и выполните разлом животного на сухом льду. Переложите замороженных червей в предварительно остывшую ступку и измельчите их в течение 2,5 минут. Добавьте в порошок 100 миллилитров жидкого азота и растирайте еще 2,5 минуты.

С помощью микроскопа проверьте, что тела червей разбиты на мелкие кусочки. Затем переложите порошок в две миллилитровые тубы и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. На сухом льду отвесьте в два раза больше 350 миллиграммов молотых червей за определенный момент времени и на каждую РНК-интерференцию бактерий в две миллилитровые пробирки.

Чтобы удалить высокорастворимые в соли белки, добавьте в каждую пробирку два объема на массу уже приготовленной RAB с ингибиторами, один миллимолярный PMSF, 200 единиц на миллилитр ДНКазы I и 100 микрограммов на миллилитр РНКазы А и растворите порошок на льду. Наберите суспензию в одномиллилитровый шприц 15 раз и выдержите на льду в течение 10 минут. Центрифугируйте при 18, 400 раз g в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.

Пройдитесь по жировому слою и соберите надосадочную жидкость, содержащую высокорастворимые в соли белки, в одну двухмиллилитровую пробирку на одну кондицию. Удалите жир и выбросьте его. Аликвоты высокосоленых растворимых белков заморозить при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Чтобы избавиться от липидов, солюбилизируйте гранулу 700 микролитрами RAB с ингибиторами, содержащими одну молярную сахарозу без ДНКазы I и РНКазы А. Наберите суспензию в шприц 10 раз и инкубируйте ее на льду в течение пяти минут. Обязательно удалите всю надосадочную жидкость и липиды и выбросьте их. Чтобы удалить SDS-растворимые белки, солюбилизируйте гранулу с 700 микролитрами буфера RIPA.

Наберите суспензию в шприц 10 раз и выдержите ее в течение 10 минут на льду. Центрифуга при 18, 400 г в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите надосадочную жидкость, содержащую SDS-растворимые белки и аликвоту, для заморозки при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Объедините по два образца каждого состояния после солюбилизации каждой гранулы с 500 микролитрами буфера RIPA и наберите суспензию в шприц 10 раз. Будьте осторожны, удалите всю надосадочную жидкость и выбросьте ее. Конечную гранулу, содержащую высоконерастворимые белки, солюбилить 400 микролитрами 70% муравьиной кислоты и набрать суспензию в шприц 20 раз.

Выдержать суспензию в течение 20 минут на льду. Центрифугируйте суспензию в ультрацентрифужных пробирках для удаления остатков кутикулы червя. Соберите надосадочную жидкость, содержащую высоконерастворимые белки, и заморозьте ее при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Общее окрашивание нерастворимого белка у молодых и старых червей выявило сильное возрастное повышение уровня высоконерастворимого белка у контрольных животных и у животных-долгожителей. Окрашивание антителами PAB-1, РНК-связывающего белка с предсказанным прион-подобным доменом, подтвердило данные масс-спектрометрии, свидетельствующие о том, что долгоживущие животные сохраняли растворимость PAB-1 с возрастом. Анализ in vivo проводили у трансгенных животных, экспрессирующих tagRFP PAB-1 в мышцах глотки.

У молодых животных tagRFP PAB-1 был в основном диффузно расположен по всему глотке. С возрастом происходит прогрессирующее накопление ярких точек, начиная с задней глоточной луковицы. Во время старения мы также наблюдали агрегацию в передней глоточной луковице у все большего числа животных.

Количественная оценка различных уровней агрегации tagRFP PAB-1 в зависимости от возраста у дикого типа и мутантного фона daf-2 выявляет сильно отсроченную агрегацию tagRFP PAB-1 с возрастом у долгоживущих животных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как собрать большое количество червей для экстракции белка и как выделить высоконерастворимые большие агрегаты для дальнейшего анализа с помощью масс-спектрометрии или страницы SDS.