Применение высокоскоростных суперразрешением скорость микроскопии в прямом первичной ресничку

Общая цель этого эксперимента — определить пути транспортировки белка в первичных ресничках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ресничек, такие как различия в путях транспортировки белка в нормальных и дисфункциональных ресничках. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обладает достаточно высоким разрешением, позволяющим видеть пути транспортировки субдифракционных белков в живых клетках.

Для начала разморозьте замороженный запас специально спроектированных из NIH-3T3 клеток при температуре 37 градусов Цельсия за полторы недели до начала эксперимента. Переложите размороженные клетки в колбу для культивирования клеток площадью 25 квадратных сантиметров, содержащую три миллилитра предварительно подогретой среды. Поддерживайте температуру в клетках при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% содержанием углекислого газа.

Культивируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут 80% конфлюенции, а затем разделите клетки. Для того чтобы разделить клетки, трипсинизируйте их 0,25%-ным трипсином в течение двух минут при температуре 37 градусов Цельсия. После короткой инкубации аспирируйте трипсин и замените его двумя миллилитрами предварительно подогретой питательной среды.

Пипетируйте среду, чтобы разбить любые клеточные кластеры, затем удалите 75% клеток из колбы и доведите общий объем среды до трех миллилитров. Перед экспериментом расщепляйте клетки не менее трех раз, чтобы обеспечить однородность их клеточного цикла. За два дня до эксперимента разделите клетки и нанесите на стеклянную дно толщиной 35 миллиметров 1,5 миллилитров той же питательной среды.

Затем, за день до эксперимента, химически трансфицируйте клетки нужной плазмидой. Смешайте 500-1000 нанограммов плазмиды в соотношении один к 2,5 с реагентом для трансфекции и 0,25 миллилитрами восстановленной сыворотки без антибиотиков в течение 30 минут. После того, как трансфекционный комплекс сформируется, аспирируйте среду из чашки со стеклянным дном 35 миллиметров, замените ее смесью для трансфекции 0,25 миллиметра и дополнительными 1,25 миллиметрами восстановленной сыворотки без антибиотиков и верните тарелку в инкубатор.

Для клеток с внешней маркировкой конструкции SSTR3 извлеките среду из стеклянной нижней чашки за час до эксперимента. Промойте клетки пять раз одним миллилитром PBS и добавьте один миллилитр восстановленной сыворотки с добавлением одного микромоляра конъюгированного стрептавидина Alexa 647. Не более чем за 15 минут до эксперимента достаньте среду из стеклянной нижней чашки и пять раз промойте клетки одним миллилитром PBS.

Затем добавьте один миллилитр буфера для визуализации в стеклянную форму с дном. Прикрепите стеклянную нижнюю пластину к предметному столику в микроскопе. Найдите экспресс-ячейку GFP с помощью набора фильтров GFP и найдите клетку, которая правильно экспрессирует SSTR3-GFP в первичной ресничке.

После того, как подходящая ячейка найдена, совместите пятно NPHP4-mCherry у основания первичных ресничек с расположением на плоскости изображения, которое соответствует освещению одной точки лазера. С помощью функции привязки на вкладке «Камера» в окне управления фокусом сделайте эпифлуоресцентное изображение белков NPHP4-mCherry и SSTR3, помеченных зеленым флуоресцентным белком. После получения эталонных изображений локально снизьте концентрацию меченых одиночных молекул путем фотообесцвечивания переходной зоны лазерным излучением мощностью в один милливатт в течение 20 секунд.

Чтобы подготовиться к отслеживанию одной молекулы, уменьшите мощность лазерного излучения до 0,5 милливатт для молекул, помеченных Alexa 647. Установите усиление и усиление на максимум, а частоту кадров на две миллисекунды. Затем нажмите кнопку трансляции на вкладке камеры в окне управления фокусом и включите соответствующий лазер подсветки.

Запишите нефотообесцвеченные меченые одиночные молекулы по мере их транспортировки через фотообесцвеченную область переходной зоны. И не забывайте записывать видео не более двух минут, чтобы избежать последствий дрейфа ресничек. После захвата отдельных молекул обработайте видео с помощью 2D-алгоритма гауссова аппроксимации, такого как Glimpse от лаборатории Геллеса, который точно локализует центроид точки возбуждения каждой отдельной молекулы, функцию распространения и охватывающую область интереса.

Наконец, выберите все положения одиночных молекул с точностью лучше 10 нанометров и скорректируйте центр ресничек на основе распределения одиночных молекул с помощью 2D-гауссовской функции. Как описано в этом видео, одноточечное освещение может быть использовано для отслеживания молекулы SSTR3, помеченной AF647, через переходную зону, отмеченную NPHP4-mCherry. Перед анализом данных наложение видео с одной молекулой на широкопольное освещение является полезным этапом проверки, чтобы убедиться, что лазер правильно выровнен и что существует адекватное соотношение сигнал/шум

На рисунке изображена клетка с первичной ресничкой, идентифицированной по окрашиванию. IFT20 является компонентом внутрижгутикового транспортного комплекса, который перевозит груз по микротрубочкам внутри первичных ресничек, отмеченных Arl13b-mCherry. После идентификации скоростная микроскопия используется для отслеживания отдельных белков IFT20-GFP.

Далее используется алгоритм преобразования из 2D в 3D для получения пространственной вероятности распределения плотности белка внутри первичных ресничек по одному измерению. Эта область высокой плотности, вероятно, колокализуется с аксонемными микротрубочками в соответствии с известным местоположением внутрижгутикового транспортного маршрута. При попытке выполнить эту процедуру важно точно выровнять образец с лазером, чтобы свести к минимуму систематическую ошибку.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как отслеживать одну молекулу с помощью скоростной микроскопии, и вы будете знать, как получить путь транспортировки одной молекулы в первичных ресничках.