Индукция и микро-КТ мозгового кавернозные мальформации в мышиной модели
4 сентября 2017 г.
Этот протокол демонстрирует индукции мозгового кавернозных мальформация болезни в мышиной модели и контраст использует расширение Микро Компьютерная томография для измерения поражения бремя. Этот метод увеличивает значение установленных мыши модели для изучения молекулярные основы и потенциальных терапий для церебральной кавернозных мальформация и другие цереброваскулярные заболевания.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы вызвать церебральные кавернозные мальформации у неонатальных мышей и измерить бремя заболевания с помощью микрокомпьютерной томографии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области церебральных сосудистых заболеваний, таких как церебральные кавернозные мальформации. Основное преимущество этого метода заключается в том, что бремя болезни кавернозной мальформации головного мозга в моделях новорожденных мышей может быть точно и эффективно определено по сравнению с существующими методами.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как индукция кавернозной мальформации головного мозга и этапы анализа микрокомпьютерной томографии сложны для изучения, поскольку это требует опыта и использования сложного программного обеспечения. Начните с растворения 4-HT в 100% этаноле до концентрации 10 миллиграммов на миллилитр. Приготовьте 30 микролитров алаквад, а затем храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
В день применения разведите алакваду в дозе 4-HT в кукурузном масле до 0,5 миллиграмм на миллилитр. Затем с помощью инсулинового шприца интрогастрально введите 50 микролитров 4-HT новорожденным детенышам P1, чтобы вызвать экспериментальные поражения CCM. Начните подготовку образца с наполнения шприца объемом 10 миллилитров, оснащенного иглой 29 калибра, тремя миллилитрами 2%-ного параформальдегида и PBS.
Затем проведите внутрисердечную продукцию эвтенизированного щенка Р8, введя иглу в желудочек мышиного сердца и медленно вводя полный объем параформальдегида. После того, как вы с помощью ножниц отделите голову, удалите кожу с головы и отклейте череп с помощью щипцов, чтобы рассечь весь мозг на 4% параформальдегида и PBS. После фиксации мозга на ночь при температуре 4-HT градусов по Цельсию.
На следующий день отделите задние мозги с помощью щипцов и промойте раствором PBS. Затем инкубируйте задний мозг в растворе йода Люголя в течение 48 часов. После инкубации кратковременно высушите задний мозг на воздухе, чтобы удалить избыток раствора йода Люголя.
Затем упакуйте окрашенные йодом задние мозги Люголя в микроцентрифужные пробирки объемом 0,65 микролитра и полностью запечатайте пластиковой парафиновой пленкой, чтобы избежать усадки тканей. Поместите микроцентрифужные пробирки в пятимиллилитровые пластиковые пробирки с губками, чтобы они не двигались во время сканирования. Вертикально установите трубку, содержащую задний мозг, на алюминиевый держатель в системе микро-КТ.
Задайте параметры сканирования. Используйте 540 проекций и двухсекундное время экспозиции при источнике 50 киловольт и 10 ватт для получения томографических наборов данных. Радиограммы сканирования автоматически восстанавливаются с помощью аппаратного программного обеспечения для реконструкции проекции, поставляемого системой микро-компьютерной томографии, создавая серию изображений из 16-битных осевых срезов.
Микрокомпьютерная томография с контрастом йода Люголя в достаточной степени выявляла поражения КМК. Отсканированные рентгеновские изображения были реконструированы для получения 3D-изображений мозга мыши, что позволило визуализировать целые поражения в паренхиме мозга на разной глубине и ориентации, а также оценить структуру в 3D-расположении поражений в мозге. В этой таблице приведен пример количественного вывода помеченных отдельных поражений.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области сосудистых заболеваний к изучению механизма и терапевтических возможностей для лечения церебральных кавернозных мальформаций на мышиных моделях. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как индуцировать поражение КМК на мышиных моделях, а также как получить и проанализировать нагрузку поражения КМК с помощью метода микро-КТ.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе демонстрируется индукция заболевания церебральных кавернозных мальформаций у новорожденных мышей и использование микро-КТ для оценки выраженности поражений. Этот метод углубляет понимание молекулярных основ и потенциальных способов терапии церебральных кавернозных мальформаций и других цереброваскулярных заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология сосудов
- Мышиные модели
Теоретическое обоснование
- Церебральные кавернозные мальформации (ЦКМ) представляют собой сосудистые поражения, которые могут приводить к серьезным неврологическим нарушениям.
- Существующие методы оценки степени выраженности заболевания на мышиных моделях зачастую малоэффективны.
- Микро-КТ позволяет неинвазивно визуализировать и количественно оценить поражения.
- Изучение ЦКМ может дать представление о других цереброваскулярных заболеваниях.
Цель исследования
- Индуцировать церебральные кавернозные мальформации у новорожденных мышей.
- Точно измерить степень тяжести заболевания с помощью микро-КТ.
- Совершенствовать методологии изучения цереброваскулярных заболеваний.
Используемые методы
- Растворение 4-HT в этаноле для приготовления раствора для индукции CCMs.
- Подготовка аликвот для хранения при -80 °C.
- Использование микро-КТ с контрастным усилением для визуализации.
- Визуальная демонстрация процесса индукции и анализа.
Основные результаты
- Данный метод позволяет точно и эффективно определять степень тяжести заболевания CCM.
- Микро-КТ обеспечивает четкую визуализацию очагов поражения в моделях мышей.
- Индукция CCM была успешно проведена у новорожденных мышей.
- Этот подход может способствовать дальнейшим исследованиям потенциальных методов терапии.
Выводы
- Данный протокол повышает ценность мышиных моделей для изучения КЦМ.
- Микро-КТ является мощным инструментом для оценки степени поражения при цереброваскулярных заболеваниях.
- Будущие исследования могут опираться на эту методологию для изучения вариантов терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественная микро-КТ визуализация церебральных кавернозных мальформаций (ЦКМ) на генетически модифицированных моделях мышей позволяет точно оценить объем поражений, что способствует снижению механистических рисков и валидации мишеней в исследованиях цереброваскулярных заболеваний. Данный подход повышает прогностическую достоверность при тестировании терапевтических гипотез на ранних стадиях и помогает в приоритизации портфеля исследований за счет обеспечения надежного и воспроизводимого количественного анализа поражений. Интеграция визуализации высокого разрешения с генетическими моделями заболеваний делает этот рабочий процесс критически важным этапом для обеспечения трансляционной непрерывности в исследованиях в области биологии сосудов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает возможность тщательного изучения функции генов CCM и их роли в патогенезе при использовании моделей заболеваний.
- Способствует снижению биологических рисков путем количественной оценки формирования очагов поражения после направленного делетирования генов.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством прямого измерения фенотипов, имеющих значение для заболевания.
- Повышает прогностическую уверенность при выборе или исключении молекулярных мишеней для дальнейшего изучения.
Скрининг и разработка анализа
- Создает валидированные модели мышей и протоколы визуализации для последующего скрининга соединений.
- Обеспечивает получение стандартизированных количественных показателей поражений, пригодных для разработки анализа и оценки воспроизводимости.
- Позволяет проводить масштабируемую высокопроизводительную оценку терапевтических вмешательств в доклинических условиях.
- Обеспечивает надежное сравнение экспериментальных условий за счет согласованных результатов визуализации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает соответствие доклинических моделей генетике заболеваний человека для разработки трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от генетического поиска до доклинической валидации терапевтических гипотез.
- Снижает трансляционный риск, предоставляя количественные конечные точки для оценки прогрессирования заболевания и эффективности вмешательства.
- Углубляет механистическое понимание цереброваскулярной патологии, имеющее значение для клинической трансляции.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод связывает этап раннего поиска с доклиническими исследованиями, обеспечивая возможность генетических манипуляций на основе гипотез и количественного фенотипирования на мышиных моделях, что способствует идентификации перспективных соединений-лидеров и согласованию трансляционных биомаркеров.
- Открывающая биология: способствует проверке нулевых гипотез и уточнению путей передачи сигналов посредством индукции и количественного анализа генетических поражений.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты визуализации для подготовки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет данные об объеме и количестве поражений для статистического сравнения экспериментальных групп.
- Трансляционные исследования: связывают генетические модели с конечными точками, имеющими значение для заболевания, для обеспечения преемственности в доклинических исследованиях.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу визуализации и анализа для различных программ исследований сосудов головного мозга.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует количественную оценку поражений и рабочие процессы визуализации для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет предоставления надежных доклинических данных.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ по изучению сосудистых заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с генетическими моделями мышей и протоколами микро-КТ визуализации.
- Необходим доступ к оборудованию для микро-КТ высокого разрешения и специализированному программному обеспечению для анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров визуализации и интерпретации данных.
- Может потребоваться адаптация протоколов для различных генетических линий или типов поражений.
- Качество данных зависит от точности подготовки образцов и условий визуализации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
