Первичного человека трофобласта модель для изучения эффекта воспаления, связанные с материнской ожирения по регулированию Autophagy в плаценту

Общей целью данной модели культуры клеток трофобласта является измерение влияния воспаления, связанного с ожирением, на регуляцию критических путей в трофобластах. Основным преимуществом этой системы контроля является установление взаимосвязи между TNF-альфа-опосредованным воспалением и регуляцией генов в плаценте в контексте материнского ожирения. Основное преимущество этой экспериментальной системы заключается в том, что она устанавливает взаимосвязь между TNF-альфа-опосредованным воспалением и регуляцией генов в плаценте в контексте материнского ожирения.

Демонстрировать процедуру будут Бейли Саймон и Мэтт Бучер, техники из моей лаборатории. Ворсинчатая ткань должна быть взята из плаценты как можно скорее после родов, предпочтительно через 30 минут или меньше. С помощью щипцов и ножниц иссеките в произвольном порядке два-три участка полной толщины на расстоянии двух-трех сантиметров от периферии плаценты.

Избегайте частей плаценты, которые выглядят ненормальными. Удалите хорионические и базальные пластины, а также любые крупные кровеносные сосуды. Поместите образовавшуюся ворсинчатую ткань в теплую, полноценную среду.

В течение 30 минут после забора ворсинчатой ткани начните выделение трофобласта. Поместите каждый кусочек ворсинчатой ткани в коническую трубку объемом 50 миллилитров, наполненную PBS комнатной температуры, и осторожно взбалтывайте, чтобы выпустить избыток крови в ткани. Сцедите PBS и замените его свежим PBS.

Повторяйте полоскание PBS до тех пор, пока не будет удалена большая часть лишней крови. Полоскатель PBS будет светло-красным или розовым при тщательном промывании ткани. Поместите ворсинчатую ткань в стерильную чашку Петри и удалите как можно больше кровеносных сосудов с помощью предметного стекла микроскопа, чтобы аккуратно соскоблить мягкую ворсинчатую ткань с сосудов.

С помощью ножниц мелко измельчите образовавшуюся ворсинчатую ткань. Переложите измельченную ворсинчатую ткань в стерильный флакон с раствором для вареживания в соответствии с рассчитанными объемами исходя из специфической активности трипсина и ДНКазы. Инкубируйте бутылочку для варивания на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием при 70 об/мин в течение 35 минут.

Через 35 минут наклоните бутылку для пищеварения на бок и дайте непереваренным кусочкам ткани осесть на дне бутылки. Осторожно наберите надосадочную жидкость серологической пипеткой, избегая осевшей ткани. Дозируйте надосадочную жидкость через сетчатый фильтр 100 микрон поровну между 50-миллилитровыми коническими пробирками.

Начните второе сбраживание, добавив раствор для вареживания к оставшимся осевшим тканям и инкубируя бутылку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Аккуратно нанесите три-пять миллилитров сыворотки для новорожденных телят (NCS) под процеженную надосадочную жидкость после первого переваривания, медленно дозируя ее из серологической пипетки на дне пробирки. Должен быть виден мениск между напряженной надосадочной жидкостью, содержащей трофобласты и NCS.

Центрифугируйте надосадочную жидкость над NCS при 1,250 g при 20 градусах Цельсия в течение 15 минут. Полученная гранула будет включать эритроциты в самом нижнем слое, за которым следует белый слой, содержащий клетки трофобласта. Таким же образом процедите надосадочную жидкость со второго и третьего переваривания.

Нанесите слой NCS под процеженную надосадочную жидкость и центрифугируйте при 1, 250 умноженных на g при 20 градусах Цельсия в течение 15 минут. После того, как все надосадочные жидкости будут центрифугированы и слои NCS и надосадочной жидкости удалены, повторно суспендируйте каждую гранулу в пяти миллилитрах теплой полной среды, а затем объедините суспензии. Разделите клеточную суспензию поровну между двумя 50-миллилитровыми коническими пробирками и центрифугируйте при 1,250 умножении g при 20 градусах Цельсия в течение 15 минут.

Аккуратно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую из клеточных гранул в шести миллилитрах теплой, полной среды. Чтобы начать эту процедуру, разделите клеточную суспензию поровну между четырьмя градиентами плотности с помощью трансферной пипетки, чтобы медленно и осторожно наложить клеточную суспензию поверх градиентов плотности. Центрифугируйте градиенты плотности при 1,250 умножении на g при 20 градусах Цельсия в течение 20 минут с минимальным ускорением и замедлением.

При этом должны образоваться различимые полосы осажденных клеток. Медленно и осторожно удалите верхний слой градиентной среды плотности до тех пор, пока не будет достигнута непрозрачная полоса, содержащая клетки трофобласта. Переложите полосы трофобласта в две 50 миллилитровые конические пробирки и заполните теплой готовой средой.

Аккуратно переверните пробирки от трех до шести раз, чтобы перемешать, и центрифугируйте при температуре 1, 250 раз g при 20 градусах Цельсия в течение 15 минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспензируйте каждую клеточную гранулу в пяти миллилитрах теплой, полной среды. Соедините клеточные суспензии и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра и трипана синего.

Следующим шагом после подсчета ячеек является нанесение пластин на ячейки. Пластина три миллиона ячеек на лунку в каждой шестилуночной пластине. Аккуратно покачивайте пластину вперед и назад и из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить ячейки.

Оставьте пластинчатые ячейки в вентиляционном отверстии ламинарного потока примерно на 30 минут, чтобы они могли равномерно распределиться, осесть и начать прилипать к дну лунок. Через 30 минут поместите пластины в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и влажностью 95%. Исследуйте трофобласты под микроскопом через 24 часа после посева, чтобы подтвердить прикрепление и правильную морфологию трофобласта.

Клетки можно обрабатывать через 24 часа после посева. Аспирируйте питательную среду из клеток и замените ее двумя миллилитрами среды с добавлением TNF альфа на лунку. Верните пластины в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия.

После 24 часов воздействия ФНО-альфа замените среду, обогащенную ФНО-альфа, на полноценную среду. Выдерживать еще 24 часа. Через 24 часа после удаления ФНО альфа аспирировать среду и аккуратно промыть клетки PBS комнатной температуры.

Добавьте непосредственно в каждую лунку 80 микролитров ледяного буфера для радиоиммуноципитуального анализа, содержащего свежедобавленные ингибиторы протеазы и фосфатазы. Удалите клетки с пластины с помощью скребка для клеток. Перенесите ячейки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, объединив лунки в группах обработки.

Охладите клетки, закручивая трубки на высокой мощности в течение как минимум трех интервалов по 15 секунд. Инкубируйте клетки при температуре четыре градуса Цельсия с покачиванием в течение 15 минут. Закрутите трубки снова на высокую мощность.

Центрифугируйте при 10 000 умноженных на g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для гранулирования клеточного мусора. Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Храните образцы клеточного белка при температуре 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не будет проведен анализ с помощью вестерн-блоттинга на наличие интересующего белка.

После 72 часов культивирования иммуноцитохимический анализ цитокератина 7, показанного красным цветом, в первичных трофобластах подтвердил, что клетки подверглись синцитиализации, о чем свидетельствует наличие многоядерных клеточных масс. Кроме того, иммуноцитохимический анализ виментина, также красного цвета, выявил очень мало загрязняющих фибробластов. Противоядерное окрашивание показано синим цветом на обоих изображениях.

Лечение ФНО альфа до 250 пикограмм на миллилитр повышает экспрессию рубикона. При концентрациях ФНО альфа более 250 пикограммов на миллилитр уровни экспрессии рубикона снижались обратно к исходному уровню и даже ниже. Аналогичным образом, рубикон значительно повышается при мгновенной заморозке биопсии ворсинчатой ткани из плаценты от беременностей с ожирением и плодами женского пола по сравнению с контрольной группой.

После освоения выделение трофобластов из ворсинчатой ткани может быть выполнено за шесть-семь часов, если оно выполнено правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно заранее подготовить материалы и реагенты, чтобы вы могли работать целенаправленно и эффективно. После этой процедуры могут быть проведены другие анализы, например, измеряющие клеточную биоэнергетику, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, влияет ли воспаление во внутриутробной среде с ожирением на метаболическую способность трофобластов?

После этого метода исследования плацентарные исследователи смогли установить влияние материнской среды на функцию трофобласта. После просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как выделить трофобласты из ворсинчатой ткани для вашего эксперимента с клеточной культурой и как определить влияние TNF-альфа-опосредованного воспаления на регуляцию критических путей в трофобластах. Не забывайте, что работа с человеческими тканями, культивируемыми клетками, ДМСО, акриламидом и восстановительными реагентами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение надлежащих СИЗ и использование асептической техники.