Нематоды Caenorhabditis Elegans - универсальный в Vivo модель для изучения хост микробных взаимодействий

Общей целью данного анализа является наблюдение за эффектом грибковой инфекции в модельном организме C.Elegans. Этот метод может помочь ответить на ключевые механистические вопросы в области инфекционных заболеваний, такие как факторы вирулентности патогенов, иммунные эффекторы хозяина, а также открытие лекарств. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она представляет собой экспериментально управляемую систему для изучения взаимодействий хозяина и патогена с обеих точек зрения.

Это быстрая, простая и экономичная система. Хотя этот конкретный метод может дать представление о грибковых патогенах, он также может быть применен к другим инфекционным агентам, таким как бактерии или даже множественные организмы, для изучения микробных взаимодействий в живом организме хозяина. Чтобы сделать червячную кирку, отрежьте 1,5-сантиметровый кусок алюминиевой проволоки, затем аккуратно вставьте примерно 0,5 сантиметра проволоки в наконечник пастерской пипетки.

С помощью горелки Бунзена или спиртовой лампы расплавьте стеклянный наконечник пипетки, медленно вращая его в пламени до тех пор, пока провод не будет надежно прикреплен к пипетке без ущерба для первоначальной формы наконечника пипетки. Наконец, с помощью щипцов аккуратно загните конец проволоки, чтобы получилась небольшая петля. Для быстрого переноса большого количества червей на новые пластины с помощью шпателя отрежьте кусок NGM агара, содержащий выбранных червей.

Затем снимите отрезанный кусок и положите его лицевой стороной вниз на край патча OP50 на новую пластину. Чтобы перенести червей по отдельности, разогрейте проволоку в червячной кирке до тех пор, пока она не станет красной, затем снимите ее с пламени и дайте ей остыть в течение нескольких секунд. Используя проволоку на пикере, аккуратно соскребите грядку культуры OP50, выращенной на новой пластине, накрыв проволоку на пикере.

Вязкая культура, покрывающая кончик проволоки, заставляет червей прилипать к кончику ямы. Таким образом, используйте движение смахивания, чтобы аккуратно подцепить выбранных червей. Как только выбранные черви будут собраны, положите их на новую тарелку, осторожно проведя культурой по агару.

Затем поместите проволоку в пламя, чтобы удалить остатки культуры на пикере. Поместите примерно 20 взрослых животных, собрав или насыпав их на тарелку, в которую положено 50 микролитров E.coli штамма OP50. Для сбора яиц через один-два дня залейте тарелку 10 миллилитрами буфера М9.

Затем с помощью стеклянной серологической пипетки взболтайте и осторожно перемешайте содержимое агаровой пластины, чтобы выпустить взрослых животных или яйца, прилипшие к OP50. Соберите всю жидкость, содержащую яйца и взрослых особей. Перелейте раствор M9 и OP50 в коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Центрифугируйте пробирку при давлении 2, 100 х г в течение двух минут. Затем аспирируйте примерно девять миллилитров надосадочной жидкости, не нарушая гранулы. Далее используйте два миллилитра стерильной воды, один миллилитр хлорной извести и один миллилитр 0,25 молярного гидроксида натрия для ресуспендирования гранулы.

Аккуратно перемешивайте методом инверсии, пока примерно 70% взрослых животных не станут лизированными. Как правило, яйца остаются неповрежденными во время этой короткой обработки отбеливателем из-за их скорлупы. На этом этапе крайне важно, чтобы количество воздействия отбеливателя было ограничено.

Длительное воздействие хлорной извести уничтожит яйца. Если подготовка яиц не удалась, либо ограничьте продолжительность воздействия хлорной извести, либо разведите раствор. Центрифугируйте коническую пробирку при давлении 990 x g в течение двух минут.

Отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Затем повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах буфера М9. После повторного вращения и удаления надосадочной жидкости, не потревожив гранулу, используйте 200 микролитров буфера M9 для ресуспендирования гранулы.

Внесите от трех до пяти миллилитров YPD в стерильную пробирку и используйте стерильную петлю, чтобы ввести в нее одну колонию Candida albicans. Поместите трубку на вращающийся барабан при температуре 30 градусов Цельсия примерно на 16–18 часов. Пометьте одну пробирку объемом 1,5 миллилитра для микрофуги как содержащую C.albicans, а другую — как OP50, затем запишите вес каждой пустой пробирки.

Перелейте 500 микролитров культуры C.albicans на ночь в пробирку с маркировкой C.Albicans. И 1500 микролитров ночной культуры OP50 в пробирку с маркировкой OP50. Центрифугируйте пробирки в течение 10 минут при давлении 16, 100 x g, затем аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы.

Используйте 500 микролитров стерильной воды для ресуспензии каждой гранулы. Затем центрифугируйте пробирки при 16, 100 х г в течение пяти минут. Отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы.

Затем запишите окончательный вес микрофуговых пробирок. Определите вес каждой гранулы, вычитая начальный вес микрофуговых пробирок из конечного веса. Используя стерильную воду, ресуспендируйте гранулы C.albicans до 10 миллиграммов на миллилитр, а гранулы OP50 до 20 миллиграммов на миллилитр.

Затем вносят мастер-инфекцию смесью, соединяя 10 микролитров по 50 мг на миллилитр раствора стрептомицина. 2,5 микролитра культуры OP50. 0,5 микролитра культуры C.Albicans и 7 микролитров стерильной воды.

Для контрольных планшетов создайте мастер-микс, заменив объем культуры C.albicans стерильной водой. Затем с помощью микропипетки закиньте 20 микролитров инфекционной смеси или контрольного раствора OP50 в центр планшетов NGM. После подготовки яиц, как показано ранее в этом видео, подсчитайте яйца в области вскрытия.

И с помощью М9 разбавляют яичный раствор до тех пор, пока не будет достигнута концентрация примерно пяти-шести здоровых яиц на микролитр. С помощью пипетки нанесите образец объемом 20 микролитров, содержащий примерно 30 яиц, на подготовленную чашку NGM в области между бактериальной культурой и боковой стороной планшета. Инкубируйте пластины при температуре 20 градусов Цельсия в течение 48 часов.

Затем под микроскопом вскрытия подсчитайте количество живых и мертвых взрослых червей на каждой пластине, считая животное мертвым, если оно не реагирует на постукивание по голове алюминиевой проволокой или постукивание по пластине. Также подсчитайте количество червей с помощью Dar и подтвердите, есть ли у животного Dar, быстро постучав по пластине на столешнице микроскопа для вскрытия.

Животные без Дара будут немедленно двигаться назад, в то время как животные с Даром будут либо нуждаться в повторных нажатиях, чтобы изменить свое направление, либо они не будут делать этого вообще. Через день переносите оставшихся взрослых червей, выбирая червей на новую инфекционную или контрольную пластину. На этом этапе, при необходимости, проведите анализ выживаемости, отслеживая количество живых, мертвых и отсутствующих червей каждый день.

Важно переносить червей как минимум через день. Это гарантирует, что взрослые черви, которые оцениваются в этом анализе, не будут сбиты с толку своим потомством. C.elegans подвергались воздействию C. albicans в течение шести дней и наблюдались на предмет признаков инфекции, прогрессирования заболевания и смерти.

Фенотип Dar наиболее заметен на четвертый день теста на выживание, о чем свидетельствует выступающая анальная область, которая не видна у неинфицированного животного. Также известно, что у червей, инфицированных C.albicans, наблюдается отек в области вульвы. В обоих случаях червь не может избавиться от инфекции после достижения этой стадии.

Для того, чтобы визуализировать колонизацию C.albicans в просвете кишечника, червей кормили диких C.albicans, помеченных RFP, которые вызывают флуоресцирование областей колонизации красным цветом. C. albicans колонизируют просвет кишечника к третьему дню анализа. Как показано здесь, у инфицированных червей наблюдалось более серьезное вздутие кишечника, чем в контрольной группе, не инфицированной.

В этом эксперименте была проверена способность червей выживать при инфекции, вызванной вирулентным двойным мутантом C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1. Черви, инфицированные двойным мутантом, живут статистически значимо дольше контрольной группы. Это позволяет предположить, что эти два гена необходимы для вирулентности C.albicans против C.elegans.

После освоения каждая часть этой техники может быть выполнена за один-два часа каждый день в течение всей жизни червя. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что вы можете использовать инфекционные агенты. Поэтому следует практиковать соответствующие меры биобезопасности.

В эту базовую процедуру могут быть внесены незначительные изменения, такие как введение дополнительных микробных агентов для изучения микробных взаимодействий в контексте живого хозяина. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области инфекционных заболеваний к изучению вирулентности микробов, механизмов врожденных иммунных реакций хозяина, а также к открытию новых противомикробных агентов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как поддерживать C.Elegans и манипулировать им, а также использовать организм для изучения взаимодействий микробов хозяина на молекулярном уровне.

Не забывайте, что работа с микробными патогенами и химическими реагентами, такими как азид натрия, может быть опасной, поэтому следует применять соответствующие меры предосторожности, такие как СИЗ и методы утилизации отходов.