Изготовление и характеристика Griffithsin модифицированные волокна подмости для профилактики передающихся половым

Общая цель этой процедуры заключается в получении и поверхностной модификации полимолочной кислоты, согликолевой кислоты, электропрядунных волокон с различными количествами противовирусного белка гриффитсина. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области доставки лекарств, например, как сформулировать и охарактеризовать новые средства доставки, которые могут предотвратить вирусные инфекции, передающиеся половым путем, такие как ВИЧ-1. Основное преимущество метода заключается в том, что противовирусная активность Гриффитзина максимизируется за счет использования полимерно-электропрядных волокон в качестве стационарного каркаса для высоколокализованного Гриффитзина на поверхности волокна.

Применение этого метода распространяется на терапию других вирусных и бактериальных инфекций из-за мощного профилактического и терапевтического потенциала Гриффитсина против различных типов инфекций. Хотя этот метод может дать представление о профилактике инфекции ВИЧ-1, он также может быть применен к другим системам, таким как другие вирусные или бактериальные инфекции, при которых Гриффитсин продемонстрировал свою эффективность. Чтобы начать эту процедуру, взвесьте 720 миллиграмм 50/50 PLGA в 10 миллилитровую сцинтилляционную мерцание.

С помощью серологической стеклянной пипетки добавьте 3,0 миллилитра HFIP. Накройте мерзость полиэтиленовой пленкой. Затем измерьте и запишите мерзкую массу.

Инкубируйте полимерную суспензию при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы обеспечить полное растворение полимера. После этого подготовьте электропрядильный аппарат так, как указано в текстовом протоколе. Используйте трехмиллилитровый шприц для отсасывания полимерного раствора.

Затем подсоедините тупой кончик иглы 18 калибра 0,5 дюйма к шприцу. Выдавите излишки раствора, чтобы удалить пустое пространство в игле. Поместите шприц на шприцевой насос и установите расход инструмента на 2,0 миллилитра в час.

Подключите источник питания к игле шприца. Электроспин полимерного раствора с помощью положительного напряжения 27 киловольт. После того как весь раствор будет электропрядением, выключите источник питания.

Дайте мандрилу покрутиться еще 30 минут, чтобы растворитель полностью испарился. Затем выключите вращающийся коллектор мандрил. С помощью бритвенного лезвия аккуратно снимите волокно с оправки.

Соберите электропрядильное волокно PLGA в чашку Петри с маркировкой. Поместите чашку в эксикатор на ночь, чтобы удалить остатки растворителя. Для начала подготовьте решения PBS и MES, как указано в текстовом протоколе.

Далее достаньте EDC и NHS из морозильной камеры. Дайте им отдохнуть, чтобы они уравновесились до комнатной температуры. После этого взвесьте четыре миллиграмма EDC в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Взвесьте шесть миллиграммов NHS в другую микроцентрифужную пробирку. Добавьте по одному миллилитру буфера MES в каждую пробирку. Энергично обработайте обе пробирки, чтобы убедиться, что реагенты полностью растворены.

Затем взвесьте 70 миллиграммов гидроксиламина в коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров. Добавьте 20 миллилитров PBS, и вортекс. Измельчите соответствующее количество волокна PLGA в коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Добавьте в клетчатку восемь миллилитров буфера MES. Затем добавьте по одному миллилитру растворов EDC и NHS. Используйте полиэтиленовую пленку для герметизации конической центрифужной трубки объемом 15 миллилитров.

Поместите трубку на вращатель, чтобы аккуратно перевернуть раствор в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого добавьте 14 микролитров бета-меркаптоэтанола для гашения реакции. Переверните трубку несколько раз, чтобы обеспечить полное перемешивание.

Выбросьте надосадочную жидкость и дважды прополощите волокно PLGA, используя 10 миллилитров PBS для каждой стирки. Добавьте в пробирку соответствующее количество исходного раствора GRFT, как указано в текстовом протоколе. Затем добавьте достаточное количество PBS, чтобы довести итоговый объем до восьми миллилитров.

Закройте и переверните трубку, чтобы обеспечить тщательное перемешивание. Заклейте трубку полиэтиленовой пленкой. Поместите трубку на вращатель, чтобы аккуратно инвертировать раствор в течение двух часов.

После этого погасите реакцию, добавив два миллилитра приготовленного раствора гидроксиламина, и вортексируйте в течение 30 секунд. Выбросьте надосадочную жидкость. Промойте поверхность модифицированным волокном PLGA дважды, используя 10 миллилитров ультрачистой воды и вортексируя для каждой стирки.

Далее переложите промытое волокно в чашку Петри. Поместите чашку Петри внутрь эксикатора, пока волокно полностью не высохнет. Затем храните чашку Петри при температуре четыре градуса Цельсия.

Для начала разложите три пробирки для микроцентрифуг объемом 1,5 миллилитров. Выньте по два миллиграмма клетчатки в каждую. Затем добавьте по одному миллилитру ДМСО в каждую трубку.

Вихрь в течение одной минуты при комнатной температуре до полного растворения волокна. После этого разведите 10 микролитров аликвоты не менее чем в 100 раз, в TE буфере. Хранить при температуре минус 20 градусов по Цельсию до загрузки с помощью Eliza.

Отвесьте от 5 до 10 миллиграммов поверхностно модифицированного волокна и переложите его в микроцентрифужную пробирку. Запишите массу волокна, помещенную в каждую трубку. Далее добавьте один миллилитр раствора, который имитирует физиологическую среду каждого образца.

Инкубируйте образцы во вращающемся вибростенде со скоростью 200 об/мин и 37 градусов Цельсия в течение одного часа. После этого удалите примерно один миллилитр раствора, содержащего десорбированный GRFT, и распределите его по кластерным пробиркам. Хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока не будет выполнено количественное определение белка.

Затем перенесите образец в новую микроцентрифужную пробирку. Добавьте один миллилитр свежего буферного раствора и инкубируйте до следующего временного момента, как указано в текстовом протоколе. В данном исследовании рассматриваются условия изготовления электропрядущих волокон PLGA.

СЭМ-анализ заготовок, 0,05 наномоля, 0,5 наномоля и 5 наномолей волокон GRFT показывает, что модификация GRFT не оказывает влияния на морфологию волокон. Все пласты имеют одинаковый средний диаметр, около 1,9 микрон, что демонстрирует согласованность модифицированного процесса изготовления для разных партий. Затем определяется количество GRFT, конъюгированного в электропрядущих волокнах.

Модификация с 5 наномолями содержит 373 нанограмма GRFT, в то время как модификация 0,5 и 0,05 содержит 165 и 42 нанограмма соответственно. Это демонстрирует, что волокна, сопряженные с более высокой теоретической плотностью модификации поверхности, приводят к большему количеству GRFT, сопряженного с волокном. Тем не менее, обратная корреляция может быть прослеживается в результирующей эффективности сопряжения.

Затем оценивается количество ковалентно конъюгированного с волокном GRFT. В течение первых четырех часов в концентрациях теоретической модификации 5 наномолей, 0,5 наномолей и 0,05 наномолей обнаруживается 113 нанограммов, 25 нанограммов и 10 нанограммов GRFT на миллиграмм электропрядильного волокна соответственно. Через четыре часа обнаруживается незначительный GRFT в разделительном элюировании для всех трех составов.

Эти данные указывают на то, что большая часть GRFT ковалентно связывается с электропрядными волокнами и что поверхностно поглощенный GRFT высвобождается в течение первых четырех часов. После освоения этой техники ее можно освоить примерно за четыре дня. Электроспиннинг каркаса из полимерного волокна, требует двух суток на приготовление полимерного раствора и электроспиннинг

В то время как модификация поверхности, последующая сушка и определение характеристик волокон требовали не менее двух дополнительных дней. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о поддержании правильного соотношения реагентов для обеспечения оптимальной модификации. Кроме того, также важно убедиться в правильности параметров электропрядения, чтобы обеспечить соответствующую морфологию волокон.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области доставки лекарств к изготовлению электропрядных волокон, которые не только инкапсулируют противовирусные агенты внутри волокна, но и обладают способностью конъюгировать активные агенты через поверхность волокна. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить электроспин полимерного волокна, выполнять поверхностную модификацию волокна с помощью противовирусного белка Гриффитсина, а также качественного конъюгированного с волокном Гриффитсина. Не забывайте, что работа с такими реагентами, как HFIP, бета-меркаптоэтанол, EDC и NHS, может быть чрезвычайно опасной.

При выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как правильное применение СИЗ и использование вытяжных шкафов для химических веществ.