Фокуса Macropatch записи синаптических токов от дрозофилы личиночной нервно-Джанкшен

Общая цель этого метода заключается в мониторинге синаптической активности визуализированных синаптических бутонов в нервно-мышечном соединении личинок дрозофилы. Отличная модельная система, легко поддающаяся генетическим манипуляциям. Этот метод может решить ключевые вопросы в вашей науке.

Например, как мутации синаптических белков регулируют синаптическую передачу. Основное преимущество этого метода заключается в том, что активность ограниченного числа участков выброса может контролироваться и регистрироваться токами быстрой кинетики и может быть легко разрешена. Для начала эксперимента:подготовьте съемник микроэлектродов.

Используйте микроскоп с 35-кратным увеличением, чтобы убедиться, что внутренний диаметр вытянутого электрода находится в диапазоне от семи до десяти микрометров. Храните капилляры в плотно закрытых емкостях, чтобы предотвратить накопление пыли. Далее обжигаем полированные капилляры с помощью микрокузницы.

Убедитесь, что конечный внутренний диаметр полированного электрода составляет пять микрометров. Затем переходите к сгибанию. Закрепите электрод в манипуляторе и расположите наконечник над нитью, не касаясь ее.

Установите теплоту на 60-70% от максимальной и нажмите на педаль микрокузницы на одну-две секунды, чтобы нагреть нить. С помощью L-образной иглы аккуратно потяните вниз кончик электрода и сделайте изгиб примерно под углом 90 градусов. Проведите электрод над пламенем горелки рукой и сделайте второй изгиб на семь-десять миллиметров от первого изгиба и под углом примерно 120 градусов.

Приготовьте гемолимфоподобный, или HL3 раствор. Храните раствор в рефигераторе и делайте его свежим каждую неделю. Подготавливайте пипетки для стимуляции так же, как и записывающие стеклянные пипетки, не сгибая их.

Далее вставьте дозатор для стимуляции в держатель микроэлектрода, подключенный к шприцу. Изготовлены диссекционные пластины из небольших чашек Петри, покрытые эпоксидной смолой из силиконовой резины. Затем с помощью щипцов выхватывают из флакона блуждающих личинок третьего возраста.

Приколите личинок, поместив первый булавка сзади, а другой булавок спереди ближе к горловым крючкам. Добавьте раствор HL3. На спинной стороне личинок делают надрез с помощью пружинных ножниц от верхнего штифта до нижнего штифта.

Приколите филе личинок, поместив по два дополнительных булавка на левую и правую стороны личинок. Удалите кишки и трахею с помощью щипцов. Перережьте нервы сразу за пределами вентрального нервного канатика с помощью пружинных ножниц.

Поставьте чашку Петри с препаратом на предметный столик для микроскопа. Вставьте электрод сравнения в ванну. Заполните записывающий электрод раствором HL3.

Под объективом 10X погрузите электрод в ванну и поместите его на мышцы шести и семи брюшных сегетатов двух, трех или четырех с помощью микроманипулятора. Затем переключите объектив на 60X и сфокусируйтесь на интересующей вас области с помощью эпифлоресценции или оптики DIC. Поместите кончик электрода на вершину синаптического бутона, затем очень осторожно прижмите электрод к мышце, так как чрезмерное давление может повредить NMJ или вызвать увеличение спонтанной синаптической активности.

Далее включаем усилитель, плату АЦП и компьютер. Затем выберите режим зажима напряжения на усилителе. Запустите программное обеспечение для сбора данных, выберите режим без разрывов и наблюдайте за появлением MEJC на экране компьютера.

Убедитесь, что амплитуда MEJC находится в диапазоне от 0,2 до 0,7 наноампер. С помощью микроманипулятора под визуальным контролем электрод стимуляции расположите рядом с аксоном, иннервирующим брюшные сегменты со второго по четвертый. Приложите отрицательное давление, потянув за поршень шприца, подключенного к держателю электрода, так, чтобы аксон был втянут внутрь электрода.

Далее включите стимулятор. Поверните ручку на блоке изоляции, чтобы установить нулевой ток, а затем осторожно увеличивайте его до появления ЕЕК или до тех пор, пока не будет достигнут порог. Проводите стимуляцию в сверхпороговом режиме.

При стимуляции ток увеличивается примерно в два раза по сравнению с пороговым значением для наблюдения ЭЕК. Измерьте сопротивление уплотнению записывающего макропатч-электрода, повернув реле сопротивления электрода усилителя в положение проверки уплотнения. Обратите внимание на значение сопротивления уплотнения в гигаомах, которое будет отображаться в текущем окне.

Запись фокальных макропатчей позволяет отслеживать синаптическую активность выбранных синаптических бутонов. Когда электрод расположен на вершине синаптического бутона, записанные MEJC имеют амплитуду, значительно превышающую уровень шума, и резко возрастающие фазы в диапазоне долей миллисекунды. При удалении записывающего электрода от синаптического бутона на несколько микрон амплитуды MEJC регистратора снижаются почти до уровня шума.

Записанные ЕЕК едва отличимы от шума и имеют длительные фазы нарастания. Фокальная запись позволяет точно обнаруживать MEJC в комплексе и гном-мутанте. В то время как межклеточные записи этого мутанта демонстрируют события выброса, которые накладываются друг на друга и не могут быть надежно обнаружены.

Регулировка углов установки электрочипа имеет решающее значение для позиционирования электрода. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как проверка визуализации отдельных событий выброса, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как интеграция активности отдельных активных зон.