Методы анализа последствий природного урана на в пробирке Osteoclastogenesis

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании влияния воздействия природного урана на жизнеспособность, дифференцировку и функцию остеокластов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области токсичности окружающей среды о влиянии воздействия урана на физиологию и метаболизм костей. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он представляет собой новый интересный инструмент для скрининга оригинаторов урана.

Когда клеточная культура RAW 264.7 достигнет конфлюенции от 85 до 90%, используйте скребок для клеток, чтобы механически поднять клетки со дна колбы для клеточных культур и перенести клетки в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Пипеткой в клеточный раствор несколько раз, чтобы разбить комки и подсчитать образовавшуюся одноклеточную суспензию. Разбавьте клетки до концентрации 10 к четвертой клеткам на миллилитр в альфа-модифицированной минимальной эфирной среде, дополненной L-глутамином и 5% фетальной бычьей сывороткой, и добавьте один миллилитр клеток на лунку в 24-луночный планшет для культивирования клеток для шестичасовой инкубации при 37 градусах Цельсия.

Важным параметром для воспроизводимости анализа дифференцировки и реабсорбции остеокластов является плотность посева клеток. Особое внимание следует уделить подсчету клеток, приготовлению клеточной суспензии и ее гомогенности перед нанесением покрытия на клетки. Для приготовления раствора соли для писсуара, начиная со стерильного водного раствора бикарбоната натрия, испытанного на стерильной клеточной культуре, сначала приготовьте и охладите 100 миллимолярный бикарбонат в воде на льду и добавьте один объем 100 миллимолярного раствора ацетата писсуара, капля за каплей, в девять объемов ледяного раствора бикарбоната с легким встряхиванием.

Дайте раствору сбалансироваться при комнатной температуре. Через три часа разбавьте соответствующий объем раствора для писсуара, капля за каплей, в среде для дифференцировки, содержащей 50 нанограмм на миллилитр RANKL, до достижения желаемой рабочей концентрации писсуара и дайте еще три часа уравновесить при комнатной температуре. Длительные этапы инкубации после каждого разведения соли мочеприемника необходимы для стабилизации писсуарных комплексов в растворах.

В конце второго периода уравновешивания аккуратно замените среду в каждой лунке одним миллилитром обработанной писсуаром или контрольной средой в зависимости от необходимости и верните клетки в инкубатор. Многоядерные остеокласты должны появиться между третьим и четвертым днем посева. Чтобы оценить размер и морфологию вновь дифференцированных остеокластов, окрашивают клетки тартрат-резистентной кислой фосфатазой в соответствии с инструкциями производителя и визуализируют всю поверхность каждой лунки с разрешением, достаточным для различения клеточных ядер.

Когда изображение всех скважин будет получено, откройте изображение одной скважины с помощью программного обеспечения ImageJ с открытым исходным кодом и проверьте единицы измерения масштаба. Затем поставьте галочку в поле Глобальный во всплывающем окне, чтобы применить новые единицы масштабирования ко всем более поздним изображениям. В меню Анализ выберите Задать измерения и установите флажки Область и Отображаемая метка.

Снимите все остальные галочки. В меню «Анализ» откройте «Инструменты», затем «Менеджер области интереса» и выберите инструмент прямоугольного выделения в главном окне ImageJ. Наметьте область интереса размером примерно 1 000 на 1 000 микрометров и нажмите кнопку Добавить, чтобы добавить выборку в Менеджер областей интереса.

Затем нажмите Еще, Сохранить, чтобы сохранить регион. Чтобы создать копию одной из пяти анализируемых областей, выберите интересующую область в Менеджере областей интересов и щелкните правой кнопкой мыши внутри выбранной области, чтобы скопировать область. Отметьте опции Показать все и Надписи и выберите инструмент выделения полигона, чтобы вручную обвести одного из остеокластов в дублирующейся области интереса.

Чтобы добавить этот контур в Менеджер областей интересов, нажмите кнопку Добавить в окне Менеджер областей интересов. Когда все остеокласты будут добавлены, выберите все контуры и нажмите кнопку Измерить, чтобы измерить их поверхности. Затем перенесите измерения, которые отображаются в окне результатов, в электронную таблицу.

Для оценки функции остеокластов, обработанных мочевым аппаратом, за день до добавления дифференцировочной среды наносили RAW клетки из 85-90% конфлюентной клеточной культуры на 24-луночный планшет для остеоанализа в питательной среде, как было показано выше. На следующий день аккуратно замените надосадочную жидкость с помощью дифференцировочного мочеприемника, содержащего среду, и позвольте RAW-клеткам дифференцироваться в остеокласты, как только что было показано. На пятый день остеокластогенеза замените содержащую писсуар среду 10% раствором отбеливателя, чтобы удалить клетки с миметической поверхности кости.

Через пять минут при комнатной температуре дважды промойте лунки деионизированной водой и дайте им высохнуть на воздухе. Затем окрасьте соли кальция на нерезорбированных участках каждой лунки 1%-ным раствором натриевой соли Alizarin Red S. Через 10 – 15 секунд удалите раствор Ализарина и аккуратно промойте лунки три-четыре раза водой.

Чтобы преобразовать RGB-изображение лунок, окрашенных ализарином, в 8-битный формат в оттенках серого, в меню «Изображение» выберите «Тип и 8-бит». Затем, используя инструмент выбора овала, очертите всю поверхность луны, которую необходимо проанализировать на резорбцию, и сохраните интересующую область, как показано только что на рисунке. Чтобы облегчить выбор пороговых значений, выберите Редактировать и Очистить снаружи, чтобы очистить все объекты за пределами определенной области интереса.

Скопируйте интересующую область, как показано только что и выберите «Настроить порог» в меню «Изображение», отрегулировав ползунок для выбора подходящего порога. Все резорбированные участки должны быть выше порога и казаться белыми, в то время как все нерезорбированные участки должны быть ниже порога и казаться красными. Чтобы завершить выбор порога, нажмите «Применить» в окне «Порог» и сохраните итоговое двоичное изображение в соответствующем интересующем формате.

Чтобы определить измерения, которые должны быть выполнены в пределах интересующей области, в меню Анализ выберите Установить измерения и отметьте флажки Площадь, Доля площади и Предел порогового значения, а также снимите все остальные флажки. Затем, чтобы получить долю резорбированной области непосредственно в окне результатов, инвертируйте дублированное двоичное изображение, выбрав «Инвертировать» в меню «Правка» и позаботившись о том, чтобы на окончательном двоичном изображении была выбрана основная область интереса, и измерьте долю резорбированной области. Изменения в количестве и размере новых дифференцированных остеокластов в ответ на уран легко видны на составных изображениях целых скважин, а также на увеличенных изображениях отдельных областей, представляющих интерес.

Размер остеокластов, выращенных в различных условиях культивирования, может быть проанализирован как показано только что путем выделения всех остеокластов в каждой области и измерения площади каждой очерченной клетки. Для исследования влияния урана на резорбционную активность остеокластов элементы RAW 264.7 покрывают и дифференцируют на остеомиметических поверхностных пластинах. В конце анализа остеокласты удаляются, а нерезорбировавшиеся участки окрашиваются и визуализируются так, как показано на рисунке.

Затем изображения преобразуются в 8-битные оттенки серого и устанавливаются пороговые значения, чтобы облегчить расчет резорбированных областей. Эта процедура также может быть применена для изучения влияния других тяжелых металлов на остеокластогенез.