Автоматизированный быстрого итеративного негативные Geotaxis Assay для анализа поведения взрослых восхождение в модели дрозофилы нейродегенеративные
12 сентября 2017 г.
Этот шаг за шагом протокола анализирует поведение отрицательных geotaxis дрозофилы , с использованием автоматизированной системы многоцилиндровых, которая содержит сотни мух и синхронизирует их действий, электродвигатель. После синхронизации assayed летать негативные geotaxis поведение, записанные в цифровом формате и проанализированы с помощью RflyDetection программного обеспечения собственной разработки.
Основная цель этого автоматизированного метода быстрого итеративного отрицательного геотаксиса заключается в анализе дефицитов в подъеме на стену взрослых мушек Drosophila, связанных с нейродегенерацией. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейронаук, такие как механизм двигательных дефицитов, связанных с нейродегенерацией. Основное преимущество этой техники заключается в том, что активность мушек при подъеме на стену может быть анализирована в автоматизированном и высокоточном профессиональном режиме.
Возможности этой техники распространяются на терапию и диагностику нейродегенерации, поскольку нейродегенеративные заболевания часто связаны с прогрессирующей потерей способности к движению и сокращением продолжительности жизни, а также нейродегенерацией, зависящей от возраста. Мы впервые задумали этот метод. Мы хотели более точно измерить локомотивную активность взрослых мушек Drosophila.
Для сбора мушек начните с содержания их на стандартной мушечной пище при температуре 25 градусов Цельсия, влажности 70% и при 12-часовом световом режиме и 12-часовом темном режиме. Собирайте девственных самок UAS-Dicer2 DDC-GAL4 под анестезией углекислым газом. Скрещивайте девственниц с двухдневными взрослыми самцами, имеющими следующие генотипа, с соотношением самец/самка один к двум.
Отдельно собирайте новоявленных самцов и самок в три пробирки для каждой группы на каждый эксперимент, помещайте по 10 мушек в каждую обычную мушечную пробирку со стандартной пищей. Затем установите пробирки при температуре 25 градусов Цельсия. Для выполнения автоматизированного RING-анализа перенесите по 10 собранных мушек каждого генотипа в каждую пробирку.
Затем закрепите пробирку винтом. Анализируйте контрольных мушек и мушек с различными генотипами вместе для каждого набора экспериментов. Включите цифровую камеру, расположенную перед аппаратом, и как только мушки загружены и готовы, начните запись.
Камера должна быть размещена горизонтально, а камера должна быть на надлежащем расстоянии от аппарата RING, чтобы зафиксировать позиции во всех мушках в относительно точных местах. После того, как мушкам дадут минуту, чтобы они осели в пробирках, включите контроллер шагов, который управляет драйвером шагов. Это заставляет небольшой электрический мотор управлять прикрепленным рычагом, так что он последовательно поднимается и стучит по аппарату четыре раза за две секунды.
После постукивания по аппарату, обратите внимание, что мушки начинают подниматься по стенке. При включенной записи, повторяйте синхронизацию, как только это было продемонстрировано, с интервалом в 60 секунд в течение трех-пяти последовательных попыток. Повторяйте эксперимент для пяти, пятнадцати, двадцати пяти и тридцати пяти дней старых мушек.
Проводите по крайней мере три независимых эксперимента для каждой группы на каждый эксперимент, с по крайней мере 30 собранными мушками или тремя пробирками. Для анализа данных импортируйте записанное видео на компьютер. Для каждой попытки сделайте снимок видео через шесть секунд после постукивания.
В программном обеспечении для обнаружения R-мушек используйте меню файла для импорта изображения скриншота. Затем, используя иконку базовой линии на панели инструментов, точно установите верхнюю и нижнюю базовые линии пробирки, а затем используйте курсор, чтобы отметить верхнюю и нижнюю базовые линии на изображении. В поле "Настройки" в поле "Мушки в прямоугольнике" введите количество мушек на пробирку, а в поле "Высота пробирки" введите длину пробирки.
Позиции отдельных мушек обнаруживаются и помечены точками на экране для каждой пробирки. Обратите внимание, что в таблице на правой панели программное обеспечение автоматически определяет расстояние подъема для каждой мушки и отображает средние значения от 10 мушек в каждой пробирке. Представляйте данные в виде среднего плюс минус SEM.
Рассчитайте значения P на основе значимости с использованием однофакторного дисперсионного анализа с тестом Бонферрони на множественное сравнение. Анализ мушек, обозначенных как Dicer2, с использованием автоматизированного RING-анализа, представленного в этом видео, показал возрастно-зависимое снижение расстояния подъема в шестисекундном интервале как для мужских, так и для женских мушек, что говорит о том, что экспрессия aux в допаминэргических или DA-нейронах является решающей для локомоторной активности мушек. Способность к подъему на стену, похоже, не затрагивается при надмерной экспрессии auxGFP в DA-нейронах и совместной экспрессии auxR и auxGFP в DA-нейронах, спасающих от фенотипа RNAi.
После освоения это можно сделать за два-три часа, если это выполняется правильно. Наличие этого развития сейчас является способом для исследователей в области нейронаук исследовать нейроде
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе подробно описывается автоматизированный метод анализа поведения Drosophila по отрицательному геотаксису с акцентом на нарушения способности взрослых особей к подъему, связанные с нейродегенерацией. В этом методе используется многоцилиндрическая система для синхронизации и записи движений мух, что позволяет получить данные о двигательных нарушениях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Поведенческий анализ
- Нейродегенерация
Теоретические основы
- Drosophila служит модельным организмом для изучения нейродегенеративных заболеваний.
- Поведение при отрицательном геотаксисе является показателем локомоторной способности мух.
- Нейродегенерация часто приводит к прогрессирующей потере подвижности и сокращению продолжительности жизни.
- Автоматизированные системы повышают точность поведенческих тестов.
Цель исследования
- Анализ нарушений способности к лазанию у Drosophila, связанных с нейродегенерацией.
- Изучение механизмов, лежащих в основе двигательного дефицита.
- Повышение точности измерения двигательной активности мух.
Используемые методы
- Автоматизированная многоцилиндрическая система для синхронного перемещения мух.
- Цифровая запись поведения при отрицательном геотаксисе.
- Анализ с использованием специализированного программного обеспечения RflyDetection.
- Быстрый итерационный анализ для высокопроизводительного сбора данных.
Основные результаты
- Успешная синхронизация движений мух для проведения точного анализа.
- Выявление дефицита способности к лазанию, связанного с нейродегенерацией.
- Автоматизированный анализ оказался эффективным и надежным.
- Потенциальное значение для терапии и диагностики нейродегенеративных заболеваний.
Выводы
- Автоматизированный анализ представляет собой надежный метод изучения локомоторного поведения Drosophila.
- Полученные данные могут лечь в основу терапевтических подходов к лечению нейродегенерации.
- Данный метод углубляет понимание взаимосвязи между двигательной активностью и нейродегенеративными состояниями.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Этот автоматизированный высокопроизводительный анализ позволяет быстро количественно оценивать нарушения локомоторной функции в моделях нейродегенерации у Drosophila, поддерживая валидацию мишеней на ранних этапах за счет предоставления объективных и воспроизводимых поведенческих показателей. Метод повышает прогностическую достоверность доклинического скрининга, позволяя одновременно анализировать сотни мух различных генотипов и возрастных групп, что облегчает эффективную оценку соединений или генетических модификаторов. Его интеграция в рабочие процессы по поиску новых лекарственных средств способствует снижению механистических рисков при работе с мишенями нейродегенеративных заболеваний за счет стандартизированного и масштабируемого фенотипирования.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки возрастного снижения способности к лазанию, связанного с нейродегенерацией в генетических моделях.
- Операционная ценность: способствует функциональной валидации мишеней за счет высокопроизводительного измерения локомоторной активности как показателя целостности нейронов.
- Прогностическая ценность: позволяет получать количественные поведенческие данные для приоритизации портфеля препаратов путем выявления генотипов со значительными двигательными нарушениями.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные, воспроизводимые показатели отрицательного геотаксиса, пригодные для валидации анализа в рамках скрининговых кампаний, направленных на изучение нейродегенерации.
- Практическая ценность: обеспечивает возможность быстрого скрининга генетических или фармакологических модификаторов с помощью автоматизированного видеозахвата и анализа в программном обеспечении RflyDetection.
- Масштабируемость: позволяет обрабатывать данные сотен мух за один запуск, что увеличивает пропускную способность и снижает вариабельность по сравнению с ручными методами анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: предоставляет релевантную с точки зрения патологии систему для оценки локомоторных фенотипов, которые соответствуют клиническим нарушениям двигательных функций при нейродегенеративных заболеваниях.
- Доклиническая преемственность: обеспечивает возможность лонгитюдного анализа в разном возрасте мух (5, 15, 25, 35 дней) для моделирования прогрессирующей нейродегенерации.
- Механистическое снижение рисков: позволяет проводить оценку экспериментов по генетическому спасению (например, коэкспрессия auxR/auxGFP) для подтверждения специфичности мишени и участия сигнального пути.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный анализ вписывается в континуум поиска лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущего соединения, предлагая количественный поведенческий конечный показатель, который связывает генетические манипуляции с фенотипическим результатом в моделях нейродегенерации.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез путем установления связи между экспрессией генов (например, aux в дофаминергических нейронах) и локомоторной функцией с помощью итеративного измерения отрицательного геотаксиса.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные результаты, готовые для анализа (дистанция подъема за 6 seconds), что позволяет проводить надежное сравнение между различными экспериментальными условиями.
- Аналитика: генерирует данные в формате среднее ± SEM с соблюдением статистической строгости (однофакторный ANOVA, поправка Бонферрони) для проведения межгрупповых сравнений и проверки значимости.
- Трансляционные исследования: связывает поведенческие показатели с нейродегенеративными механизмами, обеспечивая фенотипическую оценку в доклинических моделях в соответствии с биомаркерами.
- Повторное использование в масштабе предприятия: создает многократно используемую платформу для лонгитюдного поведенческого скрининга различных генотипов, возрастных групп и групп терапии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности с помощью количественного поведенческого фенотипирования высокого разрешения.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и стандартизацию благодаря автоматизированной синхронизации, цифровой записи и программному анализу.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет возможности быстрой оценки локомоторного дефицита на больших выборках.
- Влияние на портфель: Облегчает приоритизацию мишеней с поправкой на риск на основе надежных данных о возрастном прогрессировании фенотипа.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Drosophila, проведения и поддержания генетических скрещиваний, а также настройки поведенческих тестов.
- Необходим специализированный инструментарий, включая автоматизированный аппарат RING, ступенчатый контроллер, цифровую камеру и соответствующее освещение.
- Требуется вычислительная инфраструктура для импорта видео, извлечения кадров и работы программного обеспечения RflyDetection.
- Предусматривается стандартизация условий окружающей среды (25°C, 70% влажности, 12-часовой цикл свет/темнота) и протоколов подготовки пробирок.
- Включает меры безопасности при работе с электрическими компонентами; перед началом эксплуатации аппарат должен быть закреплен и проверен.
