Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Общая цель этой процедуры заключается в выделении неповрежденных и обогащенных бактерий, содержащих фагосомы. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как изменения в созревании фагосом и процессинге антигенов при вторжении патогенных микроорганизмов в клетки хозяина. Основное преимущество метода заключается в том, что он производит высококачественные бактерии, содержащие фагосомы, с помощью простых этапов и без необходимости использования специализированного оборудования.

Люди, плохо знакомые с этим методом, найдут его технически доступным по сравнению с методологиями, не являющимися методологиями. Впервые идея разработать этот метод пришла нам в голову, когда мы изучали механизмы, с помощью которых внутриклеточные патогены захватывают фагосомы в своих интересах. Демонстрировать эту процедуру будет Сарай Гутьеррес, постдок из моей лаборатории.

Чтобы начать культивирование Salmonella Typhimurium, используйте бактериальную петлю для инокуляции одной бактериальной колонии в 5 миллилитров инфузионного бульона для мозгового сердца. Затем инкубируйте суспензию в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия на ночь, одновременно встряхивая. На следующий день перелейте один миллилитр этой бактериальной суспензии в 19 миллилитров бульона BHI в коническую колбу.

Повторно инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия во время встряхивания. Когда OD600 достигнет единицы, выньте колбу из инкубатора и переложите культуру в 50-миллилитровую пробирку. Затем центрифугируйте пробирку при температуре 5400 x G при 4 градусах Цельсия в течение 15 минут.

После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте бактериальную гранулу в 10 миллилитрах стерильной PBS. Повторив центрифугирование один раз, повторно суспендируйте гранулу в 4,9 миллилитрах PBS. Далее добавьте в бактериальную суспензию 100 микролитров свежеприготовленного связующего раствора Биотина.

Разделив эту суспензию на пять пробирок по 1,5 миллилитров, инкубировать в термоблоке при комнатной температуре с постоянным встряхиванием при 350 об/мин в течение двух часов. После центрифугирования пробирок при 15 000 x G при комнатной температуре в течение десяти минут выбросьте надосадочную жидкость. После еще двух этапов центрифугирования и полного удаления связывающего раствора биотина повторно суспендируйте эту биотин-кодированную бактерию в одном миллилитре стерильного PBS в одной 1,5-миллилитровой пробирке.

Перелейте 100 микролитров сопряженного со стрептавидином раствора магнитных шариков в свежую пробирку объемом 1,5 миллилитра и поместите ее в магнитный штатив на пять минут. После извлечения растворителя из пробирки извлеките пробирку из магнитной стойки. Затем повторно суспензируйте шарики, которые остались в пробирке, с одним миллилитром кодированной бактериальной суспензии Биотина.

Инкубируйте пробирку на термоблоке при комнатной температуре в течение одного часа, встряхивая при 350 оборотах в минуту. Далее поместите трубку на магнитную решетку на пять минут. С помощью пипетки удалите бактерии, которые не прилипли к стенке и перенесите в новую пробирку помеченные некодированные бактерии.

Трубка с магнитными шариками, прикрепленная к стенке, содержит биотин стрептавидин кодируемые бактерии. Извлеките пробирку с биотином, стрептавидином, кодируемым бактериями, с магнитной стойки и повторно суспендируйте в одном миллилитре стерильного PBS. После того как трубка простоит на магнитной решетке пять минут, извлеките PBS.

Наконец, повторно суспендируйте промытые бактерии со стрептавидином в 500 микролитрах стерильного PBS и пометьте пробирку как закодированные бактерии. За день до заражения планшет с полностью дифференцированными BMDM в шестисантиметровой чашке в RPMI с добавлением 10% FBS. На следующий день центрифугируйте кодированную бактериальную суспензию при 15 000 x G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте бактериальную гранулу в среде RPMI с добавлением десятипроцентного FBS. Удалите среду из BMDM и добавьте пять миллилитров кодированной бактериальной суспензии в среду RPMI, чтобы инфицировать клетки. Чтобы синхронизировать фагоцитоз, инкубируйте при комнатной температуре в течение десяти минут.

Затем, чтобы инициировать фагоцитоз, инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5-процентным углекислым газом в течение 30 минут. После инкубации удалите среду из посуды и трижды промойте клетки в RPMI, чтобы удалить неинтернализованные бактерии. Для уничтожения любых нефагоцитированных бактерий в дозе десяти миллилитров RPMI, содержащих десять процентов FBS в 50 микрограммах на миллилитр гентамицина.

Наконец, инкубируйте инфицированные BMDM при температуре 37 градусов Цельсия в пятипроцентном инкубаторе с углекислым газом до желаемого момента времени. Во-первых, приготовьте необходимый объем буфера для изоляции фагосом А, добавив DTT и цитохалазин B непосредственно перед использованием, а также ингибиторы протеазы и фосфатазы в соответствии с рекомендациями производителя. Удалите среду из инфицированных клеток в нужный момент времени и промойте клетки стерильным PBS, предварительно подогретым до комнатной температуры.

Затем добавьте в блюдо 750 микролитров Phagosome Isolation Buffer A и выдерживайте на льду в течение 20 минут. Не забывайте время от времени раскачивать тарелку. Затем добавьте 250 микролитров буфера для изоляции фагосом B, а затем раскачайте пластины, чтобы буфер полностью покрывал поверхность.

Аккуратно соскребите клетки с помощью резинового полицейского, чтобы извлечь клетки из чашки и переложите их в предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку. Затем с помощью одномиллилитрового шприца проведите клеточную суспензию через иглу 26-го калибра не менее 15 раз. Далее поместите клеточный подвес на магнитную стойку на пять минут.

Частицы, прикрепленные к магнитным шарикам, являются фагосомами, содержащими кодированный S.Typhimurium. Затем перенесите суспензию, которая содержит остальные клеточные компоненты, в новую 1,5-миллилитровую пробирку, помеченную как Cytosol. Извлеките из штатива пробирку, содержащую выделенные фагосомы, и повторно суспендируйте в одном миллилитре стерильной PBS.

Поместите трубку обратно на магнитную решетку на пять минут, а затем извлеките PBS. Повторив эту промывку PBS один раз, удалите PBS и, наконец, повторно суспендируйте S.Typhimurium, содержащий фагосомы, в необходимом буфере. Для оценки эффективности биотинилирования S.Typhimurium методом конфокальной микроскопии МПДМ инфицировали меченным биотином препаратом mCherry S.Typhimurium.

После фиксации и инкубации с Cy5-стрептавидином успешное биотинилирование было подтверждено флуоресцентным сигналом Cy5-стрептавидина. Этот сигнал наблюдался исключительно у биотинилированного mCherry S.Typhimurium, тогда как у небиотинилированного mCherry S.Typhimurium он отсутствовал. Иммуноблок-анализ выделенных фагосом показал значительное обогащение mCherry экспрессирующим S.Typhimurium в фагосомах по сравнению с цитозольной фракцией.

Иммуноблок-анализ с использованием эндосом и лизосомных маркеров в изолированных фагосомах показал обогащение тестируемых маркеров в фагосомах, выделенных через четыре часа после заражения, по сравнению с 30 минутами после заражения. Когда этот протокол был применен к Staphylococcus aureus, было продемонстрировано успешное биотинилирование GFP, экспрессирующего S.aureus. После освоения этой техники она может быть выполнена примерно за полтора часа, в зависимости от времени инкубации, выбранного исследователем для заражения.

Чтобы обеспечить успешное выделение бактерий, содержащих фагосомы, убедитесь, что буферы содержат указанные концентрации и что пластины покачиваются для обеспечения однородного покрытия клеток. Кроме того, будьте осторожны при соскабливании клеток и при прохождении клеточной суспензии через иглу. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как протеомика или метаболомика, с изолированными фагосомами для изучения изменений, вызванных патогенами под действием патогенных факторов.