Эффективной и простой метод для установления линии Т-клеток у больных с хроническим активный вирус Эпштейна - Барр инфекции и НК

Общей целью этой процедуры является получение линий NK или T-клеток у пациентов с CAEBV, что имеет большое значение для исследований этого смертельного заболевания. Этот метод помогает получить линии NK или T-клеток для исследования механизма CAEBV, таких как изучение исходного VBV на пролиферацию клеток, скрининг ингибиторов, которые препятствуют пролиферации NK/T-клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она очень проста и эффективна, которая требует лишь небольшого количества периферической крови и низкой дозы железа-2 для создания линий NK или T-клеток у пациентов с CAEBV.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что выживаемость клеток в первые две недели культивирования неопределенна, и этот метод покажет вам, как определить клеточную пролиферацию ранней культуры. Когда у нас впервые появилась идея этого метода, мы обнаружили, что железо-2 в сыворотке крови человека может включать PBMC на срок до двух недель. Мы показали, что демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что она показывает форму клеток и причину пролиферации.

Чтобы начать эту процедуру, очистите первичный PBMC из двух миллилитров цельной крови пациентов с CAEBV с помощью градиентного центрифугирования. В качестве альтернативы можно разморозить криоконсервированный PBMC из жидкого азота средой RPMI-1640. Затем добавьте два микролитра 0,4% трипанового синего к 18 микролитрам клеточной суспензии, чтобы окрашивать клетки в течение трех минут, затем перенесите суспензию на клеточный счетчик и измерьте концентрацию и жизнеспособность клеток с помощью автоматического клеточного счетчика.

Приготовьте клеточную суспензию в плотности от двух до трех раз от 10 до шестой клетки на миллилитр, дополненную полной питательной средой RPMI-1640, содержащей 20% человеческой сыворотки, два миллимоляра L-глутамина и антибиотики. После этого засейте один миллилитр суспензии PBMC на лунку в 24 луночные клеточные культуральные планшеты. Далее добавьте в каждую лунку по 150 единиц на миллилитр rhIL-2.

Поместите планшеты для культивирования в инкубатор с содержанием углекислого газа с 5% содержанием углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия. На второй день наблюдайте за морфологией клеток под микроскопом при 200-кратном увеличении. Клетки находятся в хорошем состоянии, когда они яркие и круглые.

На этом этапе добавьте два микролитра 0,4% трипанового синего к 18 микролитрам клеточной суспензии и рассчитайте концентрацию клеток. Затем наблюдайте за морфологией клеток и контролируйте состояние роста клеток, нумеруя клетки перед сменой среды. Важно следить за морфологией и состоянием клеток.

Судить о выживаемости клеток можно по полиморфным клеткам и состоянию клеток на ранней стадии культуры. После этого удалите по 500 микролитров среды из каждой лунки 24-луночного планшета и добавьте в нее 500 микролитров свежей питательной среды. Затем добавьте по 150 единиц на миллилитр rhIL-2 в каждую лунку.

Меняйте среду два раза в неделю. Постройте кривую роста клеток. Когда концентрация жизнеспособных клеток превысит 5 умно-10-6 клеток на миллилитр, разделите клетки на новые лунки в концентрации 1-2 умно-10-6 клеток на миллилитр в каждой лунке.

Этот процесс занимает от двух до четырех недель. Когда клетки разрастаются, соберите один раз от 10 до шестой клетки, чтобы определить фенотипы клеточных линий. Центрифугируйте их при 240 умноженных на g в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы осадить клетки NKNT.

После этого выбросьте надосадочную жидкость, промойте осадки, добавив семь миллилитров PBS. Центрифугируйте его в течение пяти минут при 240 раз g при комнатной температуре. Повторите процедуру еще раз, затем добавьте по 200 микролитров человеческой сыворотки в каждую пробирку, хорошо перемешайте и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.

Откажитесь от надосадочной жидкости и повторно суспендируйте клетки в соотношении от 10 до 6 клеток на миллилитр с холодным PBSA. Затем разделите клетки на пять трубок, каждая из которых содержит от двух до 10 до пятых клеток. После этого центрифугируют клетки при 240-кратном g в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия Отбрасывают надосадочную жидкость и повторно суспендируют клетки с помощью PBSA буфера или PBSA, содержащего 10 микролитров PE и 10 микролитров меченных FITC антител к окрашиванию клеточных рецепторов T или NK-клеток на льду.

В качестве отрицательного контроля используются клетки, суспензированные буфером PBSA. Затем инкубируйте клетки с антителами в течение 20-30 минут на льду в темноте. Дважды промойте клетки холодным PBSA и повторно суспензируйте клетки 300 микролитрами холодного PBSA перед анализом с помощью проточного цитометра.

Когда анализ клеточного фенотипа будет завершен, осторожно удалите половину надосадочной жидкости и избегайте прикосновения к клеткам в нижней части пластины. Добавьте в планшеты такой же объем свежей питательной среды, содержащей rhIL-2 в концентрации 300 единиц на миллилитр, затем меняйте половину среды каждые три дня до тех пор, пока клеточные кластеры не станут хорошо видны под микроскопом. После этого переведите клетки из 24-луночных планшетов в колбы для культур Т-25 после смешивания разных лунок одной линии.

Увеличьте объем питательной среды в два раза по мере ее пожелтения до тех пор, пока объем среды не увеличится до 10-15 миллилитров. Вслед за этим добавьте в него rhIL-2 с концентрацией 150 единиц на миллилитр. Смените среду за 24 часа до заморозки через две-три недели роста, когда клеточную массу можно будет наблюдать невооруженным глазом.

Измерьте концентрацию клеток с помощью счетчика клеток. Затем центрифугируйте клеточную суспензию в течение пяти минут при 240-кратном g и повторно суспендируйте клеточную гранулу с плотностью от пяти до 10 раз от 10 до шестой клетки на миллилитр замороженным исходным раствором, который содержит 90% фетальной бычьей сыворотки и 10% ДМСО. Заморозьте его со скоростью один градус Цельсия в минуту до минус 80 градусов Цельсия, а затем переложите непосредственно в жидкий азот.

После трехдневного культивирования во время становления клеточных линий начинают появляться полиморфные клетки. Через семь дней клетки растут быстро, так как количество и жизнеспособность клеток увеличиваются с высокой скоростью. Небольшие скопления клеток хорошо видны через 10-14 дней роста, когда концентрация клеток превышает три-шесть раз в соотношении 10 к шестой.

В этот период клетки должны быть расширены делением на две-три лунки культивальной пластины. Примерно через месяц, когда число клеток достигает трех-пяти умноженных на 10 к седьмой, количество клеток становится достаточно высоким для сохранения. Еще одним важным вопросом является определение фенотипов после успешной культивирования клеток.

Наши результаты показывают, что Т- и NK-клетки могут быть культивированы описанным выше методом, и с помощью этого метода могут быть установлены клеточные линии, поскольку клетки росли более трех месяцев в хорошем состоянии. Этот метод, эту технику, можно сделать еще больше. Его легко выполнить должным образом.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости сохранять вариабельность PBMC. Для этой процедуры может быть использован любой метод, например, набор для анализа МТТ 8, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как токсичность линий NK или Т-клеток, которые могут быть использованы для адоптивной иммунотерапии. После каждой разработки эти методы прокладывают путь для исследователей в области CAEBV к изучению механизма ассоциированных с ВЭБ NK/T, которые включают оперативные заболевания в клеточной модельной системе.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как установить расширение линий NK и Т-клеток в соответствии с этим протоколом. Не забывайте, что работа с патогеном может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности.