Протокол для Decellularizing Cochleae мыши для внутреннего уха тканевая инженерия

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать эффективный метод децеллюляризации и декальцификации улиток мышей для использования скаффолда для инженерии тканей внутреннего уха. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области слуховой и тканевой инженерии, такие как: как 3D-улитка и различные компоненты внеклеточного матрикса влияют на дифференцировку стволовых клеток? Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет исследователю изучить, как клетки напрямую взаимодействуют с внеклеточным матриксом улитки для формирования сенсорного эпителия.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку аппарат для выделения височной кости и изобилия клеток может быть трудно правильно визуализировать, основываясь только на текстовых описаниях. Чтобы начать эту процедуру, рассеките череп пополам в средней сагиттальной плоскости с помощью острых хирургических ножниц. Далее удалите мозговую ткань из черепа.

Затем определите височную кость по наличию корешков слухового и вестибулярного нервов на внутренней части черепа и ушном канале с внешней стороны. Осторожно разрежьте череп, чтобы отделить височную кость от остальной части черепа. После этого вставьте тонкие щипцы в отверстие слухового прохода примерно на пять миллиметров, чтобы кончики не рисковали проколоть улитку.

Аккуратно разломайте кость болы, чтобы она сломалась. С помощью тонких щипцов оторвите оставшуюся часть болы от височной кости, обнажив костный лабиринт улитки. Затем погрузите височную кость в ПБС овальными и круглыми окнами улитки вверх.

С помощью ультратонкой пары щипцов удалите стапедиальную артерию, которая проходит через стремечко. Затем введите один кончик ультратонких щипцов через дугу стремени, где проходит артерия, и деликатно поднимите стремечко вверх. После этого проколите овальные и круглые окна.

После этого поместите трубку, которая подсоединена к шприцу 28,5-го калибра, заполненному PBS, над овальным окном. Проведите два миллиметра 10% антибиотик-атимикотика и 10% пенициллин-стрептомицина в PBS через улитку в течение пяти минут для удаления перилимфы. Затем удалите и выбросьте остатки мышечной ткани и костных фрагментов.

Для децеллюляризации с помощью переводной пипетки аккуратно втяните улитку вверх в пипетку так, чтобы она проходила через отрезанный край на несколько миллиметров. Затем вытолкните улитку в сцинтилляционный флакон, заполненный 1% раствором SDS. Циркулируйте два миллилитра 1%SDS в деионизированной воде через улитку в сцинтилляционном флаконе с помощью передаточной пипетки.

Поместите сцинтилляционный флакон во вращатель и дайте ему вращаться со скоростью 10 об/мин в течение 72 часов при комнатной температуре. Заменяйте его свежим раствором 1% SDS каждые 24 часа в течение 72 часов и будьте осторожны, чтобы не подвергать улитку воздействию воздуха во время замены раствора. После этого трижды промойте улитку в одном и том же сцинтилляционном флаконе по 30 минут каждый в деионизированной воде.

На этом этапе улитка должна быть децеллюляризована. Для удаления накипи удалите оставшуюся деионизионную воду из сцинтилляционного флакона, оставив ровно столько, сколько нужно для того, чтобы улитка оставалась погруженной. Чтобы начать декальцификацию, добавьте пять миллилитров 10% ЭДТА и воды DI в сцинтилляционный флакон, содержащий улитку.

Циркулируйте два миллилитра 10% ЭДТА в деионизированной воде через улитку в сцинтилляционном флаконе с помощью передаточной пипетки. Поместите сцинтилляционный флакон обратно во вращатель и дайте сцинтилляционному флакону вращаться со скоростью 10 об/мин в течение 72 часов при комнатной температуре. Меняйте решение 10%EDTA каждые 24 часа в течение 72 часов.

Будьте осторожны при смене растворов, чтобы улитка не подвергалась воздействию воздуха. Затем промойте улитку три раза в течение двух часов каждый с помощью PBS. На этом этапе улитка должна быть декальцинирована.

Перед вливанием клеток начните с инкубации децеллюляризированной и декальцинированной улитки в инкубаторе для клеточных культур с содержанием углекислого газа 5% и температурой 37 градусов Цельсия в течение как минимум одного часа. Чтобы нарастить улитки, затем добавьте каплю MSCGM в каждую улитку, чтобы предотвратить высыхание улитки. Перенесите их на новую 24-луночную пластину с помощью передаточной пипетки.

Деликатно ориентируйте улитку с помощью ультратонких щипцов так, чтобы овальные и круглые окна были обращены вверх. Затем с помощью стерильного инсулинового шприца 28,5 калибра с подсоединенной трубкой наберите 0,2 миллилитра ресуспендированных желе Уортона человека. Затем расположите трубку над овальным окном с помощью стерилизованных тонких щипцов.

Деликатно и медленно нарастите в улитку 0,2 миллилитра ресуспендированных желеобразных клеток Уортона человека в течение пяти минут. Этот этап изобилия важен. Успешное прохождение жидкости через улитку в значительной степени влияет на результат этого протокола.

После обильности добавьте 0,8 миллилитра предварительно подогретого при температуре 37 градусов Цельсия MSCGM в лунку, содержащую улитку, чтобы довести общий объем до одного миллилитра. Повторите процедуру для каждой улитки. Каждый раз используйте свежий шприц и трубку.

Поместите распущенную улитку в инкубатор для клеточных культур с температурой 37 градусов Цельсия и меняйте среду три раза в неделю. Здесь показана успешная децеллюляризация и декальцинация улитки мыши без каких-либо инъекций клеток. В целом, анатомия улитки сохранена, пустоты не оставляют пятнистого окрашивания.

Вот репрезентативные результаты успешного культивирования желейных клеток Уортона человека на каркасе улитки. Обильное пятнистое окрашивание наблюдается по всей улитке и на наружной костной поверхности. Более тщательное изучение отдельных витков показывает, что тонкие структуры улитки сохраняются после децеллюляризации и декальцинации, а также что введенные клетки прикрепляются к нативному внеклеточному матриксу улитки и/или взаимодействуют с ним.

Децеллюляризация в последующих клеточных культурах также была исследована с использованием H&E окрашивания. Децеллюляризованная улитка не содержала ни одной из клеток нативной улитки, но сохранила большую часть анатомии органа корти, поскольку внеклеточный матрикс остался. Вводимые в культивируемые клетки могут наблюдаться через кортиевый орган, взаимодействующий с децеллюляризованным внеклеточным матриксом.

После освоения обилие клеток в децеллюляризованной улитке может занять примерно от 10 до 15 минут, если улитка уже подготовлена и необходимые инструменты расположены соответствующим образом. При попытке этой процедуры важно обращаться с улиткой осторожно, так как она хрупкая. Также важно избегать попадания воздуха в улитку, так как пузырьки будут блокировать поток жидкости во время обильности.

Эта общая процедура может быть применена к улиткам других видов, а также может быть введен широкий спектр типов клеток. Конкретные сроки децеллюляризации и декальцинации, вероятно, будут различаться, но основные концепции останутся прежними. Доктор Питер Санти из Университета Миннесоты первоначально разработал технику децеллюляризации, которую мы модифицировали для этого протокола.

Мы надеемся, что наша методика и клеточная культура на каркасе улитки станут доступными для других инженеров тканей. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как успешно изолировать, децеллюляризировать и декальцинировать височные кости перед введением клеток для использования в экспериментах по культуре.