Протокол для Decellularizing Cochleae мыши для внутреннего уха тканевая инженерия
1 января 2018 г.
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации эффективным методом для decellularize и известь cochleae мыши для использования как подмости для ткани инженерных приложений.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать эффективный метод децеллюляризации и декальцификации улиток мышей для использования скаффолда для инженерии тканей внутреннего уха. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области слуховой и тканевой инженерии, такие как: как 3D-улитка и различные компоненты внеклеточного матрикса влияют на дифференцировку стволовых клеток? Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет исследователю изучить, как клетки напрямую взаимодействуют с внеклеточным матриксом улитки для формирования сенсорного эпителия.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку аппарат для выделения височной кости и изобилия клеток может быть трудно правильно визуализировать, основываясь только на текстовых описаниях. Чтобы начать эту процедуру, рассеките череп пополам в средней сагиттальной плоскости с помощью острых хирургических ножниц. Далее удалите мозговую ткань из черепа.
Затем определите височную кость по наличию корешков слухового и вестибулярного нервов на внутренней части черепа и ушном канале с внешней стороны. Осторожно разрежьте череп, чтобы отделить височную кость от остальной части черепа. После этого вставьте тонкие щипцы в отверстие слухового прохода примерно на пять миллиметров, чтобы кончики не рисковали проколоть улитку.
Аккуратно разломайте кость болы, чтобы она сломалась. С помощью тонких щипцов оторвите оставшуюся часть болы от височной кости, обнажив костный лабиринт улитки. Затем погрузите височную кость в ПБС овальными и круглыми окнами улитки вверх.
С помощью ультратонкой пары щипцов удалите стапедиальную артерию, которая проходит через стремечко. Затем введите один кончик ультратонких щипцов через дугу стремени, где проходит артерия, и деликатно поднимите стремечко вверх. После этого проколите овальные и круглые окна.
После этого поместите трубку, которая подсоединена к шприцу 28,5-го калибра, заполненному PBS, над овальным окном. Проведите два миллиметра 10% антибиотик-атимикотика и 10% пенициллин-стрептомицина в PBS через улитку в течение пяти минут для удаления перилимфы. Затем удалите и выбросьте остатки мышечной ткани и костных фрагментов.
Для децеллюляризации с помощью переводной пипетки аккуратно втяните улитку вверх в пипетку так, чтобы она проходила через отрезанный край на несколько миллиметров. Затем вытолкните улитку в сцинтилляционный флакон, заполненный 1% раствором SDS. Циркулируйте два миллилитра 1%SDS в деионизированной воде через улитку в сцинтилляционном флаконе с помощью передаточной пипетки.
Поместите сцинтилляционный флакон во вращатель и дайте ему вращаться со скоростью 10 об/мин в течение 72 часов при комнатной температуре. Заменяйте его свежим раствором 1% SDS каждые 24 часа в течение 72 часов и будьте осторожны, чтобы не подвергать улитку воздействию воздуха во время замены раствора. После этого трижды промойте улитку в одном и том же сцинтилляционном флаконе по 30 минут каждый в деионизированной воде.
На этом этапе улитка должна быть децеллюляризована. Для удаления накипи удалите оставшуюся деионизионную воду из сцинтилляционного флакона, оставив ровно столько, сколько нужно для того, чтобы улитка оставалась погруженной. Чтобы начать декальцификацию, добавьте пять миллилитров 10% ЭДТА и воды DI в сцинтилляционный флакон, содержащий улитку.
Циркулируйте два миллилитра 10% ЭДТА в деионизированной воде через улитку в сцинтилляционном флаконе с помощью передаточной пипетки. Поместите сцинтилляционный флакон обратно во вращатель и дайте сцинтилляционному флакону вращаться со скоростью 10 об/мин в течение 72 часов при комнатной температуре. Меняйте решение 10%EDTA каждые 24 часа в течение 72 часов.
Будьте осторожны при смене растворов, чтобы улитка не подвергалась воздействию воздуха. Затем промойте улитку три раза в течение двух часов каждый с помощью PBS. На этом этапе улитка должна быть декальцинирована.
Перед вливанием клеток начните с инкубации децеллюляризированной и декальцинированной улитки в инкубаторе для клеточных культур с содержанием углекислого газа 5% и температурой 37 градусов Цельсия в течение как минимум одного часа. Чтобы нарастить улитки, затем добавьте каплю MSCGM в каждую улитку, чтобы предотвратить высыхание улитки. Перенесите их на новую 24-луночную пластину с помощью передаточной пипетки.
Деликатно ориентируйте улитку с помощью ультратонких щипцов так, чтобы овальные и круглые окна были обращены вверх. Затем с помощью стерильного инсулинового шприца 28,5 калибра с подсоединенной трубкой наберите 0,2 миллилитра ресуспендированных желе Уортона человека. Затем расположите трубку над овальным окном с помощью стерилизованных тонких щипцов.
Деликатно и медленно нарастите в улитку 0,2 миллилитра ресуспендированных желеобразных клеток Уортона человека в течение пяти минут. Этот этап изобилия важен. Успешное прохождение жидкости через улитку в значительной степени влияет на результат этого протокола.
После обильности добавьте 0,8 миллилитра предварительно подогретого при температуре 37 градусов Цельсия MSCGM в лунку, содержащую улитку, чтобы довести общий объем до одного миллилитра. Повторите процедуру для каждой улитки. Каждый раз используйте свежий шприц и трубку.
Поместите распущенную улитку в инкубатор для клеточных культур с температурой 37 градусов Цельсия и меняйте среду три раза в неделю. Здесь показана успешная децеллюляризация и декальцинация улитки мыши без каких-либо инъекций клеток. В целом, анатомия улитки сохранена, пустоты не оставляют пятнистого окрашивания.
Вот репрезентативные результаты успешного культивирования желейных клеток Уортона человека на каркасе улитки. Обильное пятнистое окрашивание наблюдается по всей улитке и на наружной костной поверхности. Более тщательное изучение отдельных витков показывает, что тонкие структуры улитки сохраняются после децеллюляризации и декальцинации, а также что введенные клетки прикрепляются к нативному внеклеточному матриксу улитки и/или взаимодействуют с ним.
Децеллюляризация в последующих клеточных культурах также была исследована с использованием H&E окрашивания. Децеллюляризованная улитка не содержала ни одной из клеток нативной улитки, но сохранила большую часть анатомии органа корти, поскольку внеклеточный матрикс остался. Вводимые в культивируемые клетки могут наблюдаться через кортиевый орган, взаимодействующий с децеллюляризованным внеклеточным матриксом.
После освоения обилие клеток в децеллюляризованной улитке может занять примерно от 10 до 15 минут, если улитка уже подготовлена и необходимые инструменты расположены соответствующим образом. При попытке этой процедуры важно обращаться с улиткой осторожно, так как она хрупкая. Также важно избегать попадания воздуха в улитку, так как пузырьки будут блокировать поток жидкости во время обильности.
Эта общая процедура может быть применена к улиткам других видов, а также может быть введен широкий спектр типов клеток. Конкретные сроки децеллюляризации и декальцинации, вероятно, будут различаться, но основные концепции останутся прежними. Доктор Питер Санти из Университета Миннесоты первоначально разработал технику децеллюляризации, которую мы модифицировали для этого протокола.
Мы надеемся, что наша методика и клеточная культура на каркасе улитки станут доступными для других инженеров тканей. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как успешно изолировать, децеллюляризировать и декальцинировать височные кости перед введением клеток для использования в экспериментах по культуре.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен эффективный метод децеллюляризации и декальцификации улиток мыши для их использования в качестве скаффолдов в задачах тканевой инженерии. Эта методика позволяет исследователям изучать взаимодействие между клетками и внеклеточным матриксом улитки, что имеет решающее значение для понимания процесса формирования сенсорного эпителия.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Тканевая инженерия
- Исследования слуховой системы
- Клеточные взаимодействия
Теоретическая часть
- Децеллюляризация и декальцинация необходимы для создания скаффолдов.
- Понимание структуры улитки имеет жизненно важное значение для исследований внутреннего уха.
- Дифференцировка стволовых клеток находится под влиянием внеклеточного матрикса.
- Визуальные методы улучшают понимание сложных процедур.
Цель исследования
- Обеспечить надежный метод подготовки каркаса улитки.
- Способствовать проведению исследований взаимодействий клеток улитки.
- Расширить знания в области слухового аппарата и тканевой инженерии.
Используемые методы
- Выделение височной кости из черепа.
- Децеллюляризация улиток.
- Процесс декальцинации для подготовки скаффолда.
- Наглядная демонстрация процедуры для ясности.
Основные результаты
- Успешная децеллюляризация и декальцинация улиток мыши.
- Углубленное понимание взаимодействий между клетками и внеклеточным матриксом.
- Улучшенные методы изучения формирования сенсорного эпителия.
- Наглядные пособия значительно облегчают понимание процедуры.
Выводы
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для исследований внутреннего уха.
- Он открывает возможности для изучения поведения стволовых клеток в кохлеарных скаффолдах.
- Визуальные демонстрации имеют решающее значение для сложных биологических процедур.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет научно-исследовательским группам в области биофармацевтики создавать физиологически релевантные каркасы улитки для изучения взаимодействия стволовых клеток с нативным внеклеточным матриксом, что способствует валидации мишеней в регенеративной медицине слуха. Сохраняя архитектуру внеклеточного матрикса при удалении клеточных компонентов, этот метод обеспечивает создание определенной системы для снижения рисков при проверке механистических гипотез о поведении клеток, опосредованном матриксом, в тканевой инженерии внутреннего уха. Данный подход поддерживает разработку доклинических моделей для терапии потери слуха, позволяя проводить контролируемую оценку динамики взаимодействия клеток и каркаса в трехмерной системе, релевантной патологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы о влиянии внеклеточного матрикса на дифференцировку стволовых клеток и формирование сенсорного эпителия.
- Практическая ценность: Обеспечивает биологическую проверку мишеней (de-risking) путем изоляции специфических эффектов матрикса от клеточных переменных в контролируемой системе каркаса.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет создавать стандартизированные, воспроизводимые биологические системы для количественной оценки инвазии клеток, их пролиферации и взаимодействия с матриксом.
- Практическая ценность: обеспечивает масштабируемость анализа и возможность повторного использования платформы за счет получения единообразных результатов децеллюляризации и декальцификации нескольких улиток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает непрерывность системы исследования заболевания — от этапа открытия до доклинической валидации — за счет сохранения нативной архитектуры улитки.
- Практическая ценность: Облегчает принятие решений о дальнейшем развитии проекта с учетом рисков, позволяя проводить лонгитюдное наблюдение за взаимодействием клеток и каркаса в течение 30-дневных периодов культивирования.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс поиска новых препаратов, обеспечивая создание каркасов из внеклеточного матрикса после изоляции, что позволяет проверять гипотезы на этапах идентификации ведущих соединений перед проведением доклинических испытаний эффективности.
- Поисковая биология: способствует уточнению сигнальных путей и снижению механистических рисков, позволяя напрямую изучать взаимодействия между клетками и внеклеточным матриксом без влияния клеточного детрита.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного приготовления скаффолда, который сохраняет структурную целостность для надежной оценки соединений или клеток.
- Аналитика: позволяет получать количественные измерения зависимых переменных через глубину инвазии клеток, скорость пролиферации и паттерны взаимодействия с матриксом, наблюдаемые с помощью окрашивания и визуализации.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет сохранения структуры органа Кортеу, что позволяет экстраполировать результаты на условия, приближенные к in vivo.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую платформу скаффолдов, применимую для различных типов клеток и видов, что сокращает затраты на повторную изоляцию в программах по инженерии слуховых тканей.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышение достоверности прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в поведении клеток, опосредованном внеклеточным матриксом.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря четко определенным протоколам децеллюляризации (72-часовая ротация SDS) и декальцинации (72-часовая ротация EDTA).
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений «продолжать/прекратить» (go/no-go) за счет возможности ранней оценки клеточных ответов, зависящих от матрикса, что снижает биологические риски на поздних этапах программ регенерации слуха.
- Влияние на портфель: Приоритизация кандидатов из числа стволовых клеток или модуляторов матрикса с учетом рисков на основе функциональных показателей, полученных при использовании скаффолдов.
Особенности реализации
- Необходим опыт в микрохирургической изоляции височной кости и методах стерильной перфузии клеток.
- Требуемое оборудование включает сверхтонкие пинцеты, переносные пипетки, ротаторы и стерильные системы перфузии с использованием шприцев.
- Стандартизация между исследовательскими группами требует строгого соблюдения графика замены растворов и предотвращения контакта с воздухом в процессе децеллюляризации/декальцинации.
- При адаптации метода следует учитывать необходимость корректировки временных интервалов в зависимости от вида и валидации целостности скаффолда для альтернативных типов клеток, помимо МСК из желеобразного вещества пуповины Уортона.
- Практические ограничения включают хрупкость улитки, что требует осторожного обращения для предотвращения структурных повреждений во время изоляции и перфузии.
