Обобщение и оценка ингибитор поглощения на основе рутений митохондриальной кальция

Общая цель синтеза и очистки состоит в том, чтобы относительно легко получить аналог рутения-360, используемый в анализах митохондриального поглощения кальция, который был бы в 10 раз эффективнее, чем коммерчески доступный рутений-360. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии митохондриального кальция, обеспечивая чистый ингибитор поглощения кальция митохондриями. Основное преимущество этой методики заключается в том, что конечный продукт получается одновременно очень мощным и чистым.

Люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, потому что очищение требует времени и терпения. Продюсера будет демонстрировать Сара Натан, аспирантка из моей лаборатории. Начните эту процедуру с синтеза пентааммина хлоррутения дихлорида, как описано в текстовом протоколе.

Растворите 100 миллиграммов пентааммина хлоррутения дихлорида в 50 миллилитрах одного молярного раствора гидроксида аммония в колбе с круглым дном объемом 200 миллилитров. Неплотно закройте колбу стеклянной пробкой и нагревайте реакционную смесь до 75 градусов Цельсия в течение шести часов. Нагрев герметичного сосуда приводит к повышению давления.

Убедитесь, что стеклянная пробка ослаблена, чтобы обеспечить сброс избыточного давления. Через шесть часов снимите реакционную смесь с огня. И помешиваем при комнатной температуре в течение четырех дней, чтобы получился темно-зеленый раствор.

Для очистки полученного транс-диаква октоамина мю-оксо дирутения пентахлорида методом катионобменной хроматографии сначала суспендируют пять граммов сетчатой катионитающей смолы в 10 миллилитрах 0,1 молярного HCL в стакане объемом 25 миллилитров. Загрузите эту суспензию в колонну объемом 10 миллилитров с резервуаром для растворителя объемом 50 миллилитров. Промойте смолу примерно 20-30 миллилитрами 0,1 молярного HCL до тех пор, пока элюй не станет бесцветным.

Затем добавьте концентрированную HCL в ранее выделенный зеленый реакционный раствор, чтобы довести PH до двух, после чего цвет раствора изменится на коричневый. Загрузите этот подкисленный раствор в колонну катионитобменной смолы, аккуратно нанеся его пипетированием поверх смолы. Дайте элюю полностью стечь и продолжайте загрузку раствора.

Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет добавлен весь раствор. Верх смолы будет темно-коричневым или черным. Смола немного уменьшится в объеме.

Затем покройте верхнюю часть смолы стеклянными шариками, чтобы смола не потревожилась при добавлении новых растворов. Разбавьте колонку 20 миллилитрами одного молярного HCL. Затем вымывают колонку с 50 миллилитрами повышенной концентрации HCL 1,5 моляра.

Желтый раствор начнет отходить от колонки. Затем увеличьте концентрацию HCL до двух моляров и продолжайте элюирование от 150 до 200 миллилитров. Элюант начнет с очень бледно-желтого цвета и перейдет к ярко-желтому.

Подождите, пока элюант, выходящий из колонны, снова станет очень бледным. На этом этапе решающее значение имеет терпение. Элюант должен быть очень бледным.

Увеличьте концентрацию HCL до 2,5 моляра. Соберите элюант в виде фракций в пробирки. Наконец, увеличьте концентрацию до трех моляров HCL.

Продукт будет вымываться из колонки в виде зелено-коричневого раствора. Красно-коричневая фракция также может начать отходить от колонки. Эти фракции являются коричневыми примесями рутения и не должны объединяться с зелено-коричневыми фракциями.

Чтобы проверить все фракции с помощью УФ-ВИД спектроскопии, добавьте 100 микролитров данной фракции в два миллилитра трех моляров аммиака. Затем проанализируйте смесь с помощью УФ-ВИД спектроскопии. Фракции, содержащие чистый продукт, будут иметь большую полосу поглощения на 360 нанометрах и менее интенсивную полосу поглощения на 600 нанометрах.

Поглощение на глубине 480 нанометров указывает на коричневый рутений, а поглощение на глубине 533 нанометров представляет собой красные примеси рутения. Другие примеси наблюдаются при поглощении менее 300 нанометров. Соберите фракции, содержащие чистый продукт, и выпарите раствор до сухости методом ротационного выпаривания перед анализом образца в твердом состоянии методом ИК-спектроскопии.

Перейдите к оценке ингибирования поглощения кальция митохондриями с помощью флуоресцентной спектроскопии, как подробно описано в текстовом протоколе. УФ-ВИД спектры очищенного транс-диаква октоамина мю-оксо дирутении пентахлорида характеризуется большим и малым поглощениями на 360 нм и 600 нм соответственно. И наоборот, нечистая смесь имеет полосы поглощения на расстоянии 533 нанометра от красных примесей рутения и на расстоянии от 275 до 300 нанометров от исходного материала.

Определение характеристик твердого тела с помощью инфракрасной спектроскопии имеет ожидаемые растяжения от аминов. Так же как и рутений кислородный рутений растягивается на 850 сантиметров. Пермеабализированные клетки HeLa, обработанные чувствительным к кальцию флуоресцентным красителем и транс-диаква октоамином mu-oxo дирутении пентахлорид, демонстрируют ингибирование поглощения кальция митохондриями.

При попытке проведения процедуры важно помнить о том, что фракции должны полностью размыться. Терпение даст чистый продукт. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как синтезировать, очистить и охарактеризовать этот мощный аналог рутения 360.

Уровень кальция в митохондриях регулирует широкий спектр межклеточных процессов, включая биоэнергетику и контролируемую гибель клеток. Ингибитор, полученный с помощью этого метода, может быть применен в исследованиях, чтобы понять роль биологии митохондриального кальция в опосредовании других биологических процессов. Не забывайте, что работа с концентрированными кислотами и основаниями вызывает коррозию, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение надлежащих СИЗ.