Анализ иммунокомпетентных клеток в одном седалищного нервов и спинной корень ганглия от одной мыши с помощью проточной цитометрии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить достаточное количество клеток из ганглиев дорсальных корешков и седалищных нервов отдельной мыши, чтобы иметь возможность проводить анализ клеток с помощью проточной цитометрии. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что периферический нейронный материал генерирует большое количество мусора при переваривании. Основное преимущество этого метода заключается в том, что для идентификации нескольких типов клеток можно одновременно использовать несколько маркеров.

Применение этого метода распространяется на диагностику воспаления и иммунопатологии во время нейропатии. В то время как этот метод может дать представление о мышиных моделях, он также может быть применен к другим организмам, таким как нервы человека и свиньи, с незначительными модификациями. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за большого количества мусора, образующегося в процессе пищеварения.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы диссекции и диссоциации клеток трудно выполнить, поскольку количество нейронного материала на мышь ограничено. Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы увидели протокол по выделению лебединой клетки из седалищного нерва из лаборатории Стива Лакруа. Для начала подготовьте мышь, как описано в прилагаемом текстовом протоколе, и расположите ее вентральной стороной вниз, вытягивая нижние конечности.

Затем с помощью щипцов двусторонне рассеките все седалищные нервы. Начните с отделения мышечной ткани от верхней спинной части бедра и проследите за нервом вверх по позвоночному столбу. Перережьте нерв в том месте, где он выходит из позвоночного столба и непосредственно над коленом на другом конце.

Затем перенесите иссеченные нервы в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 1 миллилитр ледяного PBS. Храните нервы на льду. Далее изолируйте ганглий дорсального корешка.

Начните с разрезания ребер параллельно позвоночному столбу и близко к нему с обеих сторон. Затем поперечно разрежьте позвоночный столб на уровне бедренных костей с задней стороны и вплотную к черепу с передней стороны. Удалите позвоночный столб и с помощью ножниц по радужной оболочке глаза удалите все мышцы, жир и другие мягкие ткани из позвоночника.

Затем поместите позвоночный столб вентральной стороной вверх и откройте его, начиная с каудального конца, скользя одним кончиком ножниц в позвоночный канал в положении «12 часов» и отрезая кость. Продолжая до тех пор, пока весь позвоночник не будет разрезан, повторяйте эту процедуру в положении «шесть часов», пока позвоночник не будет уменьшен вдвое. Отделите две половины позвоночника, затем поместите образец под микроскоп для вскрытия.

Удалите спинной мозг, чтобы обнажить спинномозговые нервы, затем найдите и удалите ганглии спинного корешка поясничного отдела, осторожно потянув за спинной корешок, чтобы втянуть его в позвоночные каналы. Затем используйте ножницы для радужной оболочки, чтобы обрезать нервы и соединительную ткань вокруг ганглия дорсального корня. С помощью щипцов перенесите ганглии тыльного корешка в трубку объемом 1,5 миллилитра и храните их на льду.

Чтобы найти ганглии дорсального корешка, извлечь их, не повредив, и освободить от спинномозгового нерва, требуется упражнение и навыки. Приготовьте среду для пищеварения, дополните ее ста микрограммами на миллилитр дезоксирибонуклеазы и храните ее на льду. Затем добавьте по 500 микролитров питательной среды в каждую из трубок с седалищными нервами и ганглиями дорсальных корешков.

Для седалищных нервов измельчите материал от 15 до 20 раз с помощью пружинных ножниц, а затем инкубируйте тканевые суспензии в трясущемся инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут с легким перемешиванием. После инкубации повторно растирайте суспензию клеток через наконечник пипетки объемом 1000 микролитров, чтобы механически диссоциировать любую не полностью переваренную ткань. Повторите растирание через наконечник пипетки объемом 1 000 микролитров.

Затем инкубируйте образец еще 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия при слабом перемешивании. Приготовьте ледяной буфер FACS и используйте его для промывки и замачивания экрана из нержавеющей стали с размером ячеек 140 микрон в 60-миллиметровой чашке Петри на льду. Затем с помощью тупых щипцов удерживайте сетчатый фильтр 140 микрон над чашкой Петри и многократно пропустите тканевые суспензии через фильтр.

Соберите клеточную суспензию из чашки Петри и перенесите ее в ту же 1,5-миллилитровую пробирку, хранящуюся на льду. Протолкните через фильтр не до конца переваренную ткань путем многократного растирания наконечником пипетки объемом 1 000 микролитров. Затем дважды промойте сетчатый фильтр 500 микролитрами буфера FACS и соедините его с клеточной суспензией в 1,5-миллилитровой трубке.

Если слишком большая часть образца не полностью переваривается и проходит через металлическую сетку, может произойти потеря клеток и анализ проточной цитометрии может оказаться невозможным. Центрифугируйте клеточные суспензии и выбросьте надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре буфера FACS.

Повторите этот этап промывки один раз, повторно суспензивая конечную клеточную гранулу в 150-350 микролитрах буфера FACS. Теперь клетки готовы к окрашиванию. На компьютере выберите подходящие каналы для детектирования интересующих флуорофоров, соответствующую скорость потока образцов и общее количество событий, которые должны быть собраны для каждого образца.

Минимальное количество событий должно составлять один миллион. Затем создайте диаграммы рассеяния на глобальном листе бокового рассеяния A и прямого рассеяния A, а также для каждого интересующего флуорофора в сравнении с прямым разбросом A. Кроме того, создайте статистическое представление, в котором будет отображаться количество событий и средняя интенсивность флуоресценции для выбранных флуорофоров. Определите родительский вентиль, P1, на основе диаграммы рассеяния от элементов управления окрашиванием DAPI.

Подсоедините образец к проточной цитометрии и нажмите кнопку «Получить». Наблюдайте за графиком зависимости DAPI от FSC и снижайте напряжение тихоокеанского синего канала ДНК до тех пор, пока популяция DAPI+ не станет видимой. С помощью инструмента стробирования прямоугольника нарисуйте прямоугольник вокруг DAPI+population.

Он представляет собой вентиль P1. Выберите точечные диаграммы для каждого из флуорофоров и отобразите только события DAPI+. Он представляет собой фоновую флуоресценцию для каждого из флуорофоров.

Используя прямоугольное стробирование, нарисуйте прямоугольник на диаграммах рассеяния для каждого из флуорофоров, начиная со 103 по оси y. Этот вентиль представляет область, в которой должны быть найдены положительные события для каждого из указанных маркеров. Отрегулируйте напряжение для каждого из флуорофоров с помощью элементов управления окрашиванием только DAPI.

Подсоедините образец к проточной цитометрии и нажмите кнопку «Получить». Наблюдайте за положением популяции DAPI+ для каждого из флуорофоров и регулируйте соответствующие напряжения таким образом, чтобы популяции выходили за пределы прямоугольного затвора. После настройки проточного цитометра запустите образцы и экспортируйте файлы Forward Scatter для дальнейшего анализа.

Вымывание красителя DAPI перед анализом с помощью проточной цитометрии снижало интенсивность флуоресценции неядерного мусора. Это позволило исключить материал на верхнем конце оси прямого рассеяния, который содержит не полностью переваренную ткань, при отборе синглетной популяции. В целом, более 30 000 синглетов можно регулярно получать из двух полных седалищных нервов и более 200 000 синглетов можно получить из ганглиев дорсальных корешков.

Из седалищных нервов примерно 5% синглетов экспрессировали CD45 на своей поверхности, в то время как примерно от 5% до 10% экспрессировали его в ганглиях дорсальных корешков, тем самым определяя эти клетки как лейкоциты гемопоэтического происхождения. Большинство CD45-положительных синглетов также экспрессировали MHC класса II постепенно. Однако в ганглиях дорсальных корешков CD11b может быть использован для обнаружения микроглиальных клеток; Эта популяция микроглии отсутствует в седалищных нервах.

В ганглии седалищного нерва и дорсального корешка от 2% до 5% синглетов экспрессировали CD68. В седалищных нервах примерно 60%80% CD68-положительных макрофагов экспрессировали CD206. В то время как меньшая часть CD68-положительного коэкспрессировала CD206 в ганглии дорсального корешка.

При выполнении этой процедуры важно поддерживать постоянную температуру, чтобы обеспечить стабильный результат. После своего развития этот метод позволил исследователям в области диабета изучить токсические эффекты стрептозотоцина, используемого для индуцирования диабета у мышей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить проточную цитометрию на периферической нервной ткани.

Не забывайте, что работа с параформальдегидом может быть опасной, поэтому всегда следует принимать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и защитных очков.