В пробирке Фермент измерения для испытания фармакологических Chaperone реагирования в Фабри и Pompe болезни

Существует требование сделать Доклинические испытания для класса Роман «сирота» препаратов, называемых фармакологических сопровождающих, воспроизводимость, быстро и эффективно. Мы разработали на основе культуры пробирного высоко стандартизированных, простой и универсальный мобильный экран для право пациентов, а также сопровождающий Роман фармакологических препаратов.

Общая цель этого измененного протокола культивирования клеток заключается в том, чтобы обеспечить быструю фенотипическую оценку аллельной вариабельности при болезни Фабри и Помпе. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области лизосомальных болезней накопления, такие как прогностические исходы и терапевтические решения. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обладает высокой воспроизводимостью и может помочь в разработке новых лекарств, таких как фармакошапероны.

Чтобы провести сайт-направленный мутагенез, начните с использования референсных последовательностей NM 00169.2 и NM 00152.4 в качестве шаблонов для мутагенеза генов GLA и GAA, соответственно. Используйте бесплатный инструмент Primer Design для поддержки дизайна грунтовки. Затем у вас есть набор высокочистых, бессолевых праймеров, синтезированных коммерческим поставщиком, с смысловыми и антисмысловыми праймерами, несущими одну из соответствующих модификаций последовательности, центральную по их длине, для индивидуального введения мутации.

Приготовьте реакционную смесь в объеме 50 микролитров и запустите программу ПЦР в стандартных условиях, предоставленных производителем и перечисленных в текстовом протоколе. После ПЦР добавьте один микролитр фермента рестрикции Dpn1 и продолжайте инкубировать флаконы реакции при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. После трансформации плазменной ДНК в компетентные клетки E.coli и получения плазмид желаемой трансформации в соответствии с текстовым протоколом, используйте подходящий инструмент молекулярной биологии для анализа последовательности.

При обнаружении желаемой мутации и отсутствии дальнейших аномалий последовательности по сравнению с NM 000169.2 для альфа-галактозидазы A или NM 000152.4 для кислотной альфа-галактозидазы, выберите клон для очистки плазмид трансфекционного уровня. Определить чистоту ДНК можно путем измерения поглощения в спектрофотометре. После культивирования HEK293H клеток в колбе с культурой T75 в соответствии с текстовым протоколом, за 24 часа до трансфекции, используйте PBS без кальция или магния для однократной промывки клеток.

С 0,05% трипсина-ЭДТА соберите клетки и в полостях 24-луночного планшета используйте 500 микролитров DMEM с добавлением 10% FBS для посева в 1,5 раза по 10 на пять клеток. Проводите клеточную трансфекцию в соответствии с инструкцией производителя. Используют смесь из одного микрограмма плазмидной ДНК, растворенной в 100 микролитрах бессывороточного DMEM и 2,5 микролитрах трансфекционного реагента.

Инкубируйте раствор в течение 20 минут при комнатной температуре, затем добавляйте его в ячейки по каплям. Через четыре часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 удалите среду, содержащую реагент для трансфекции, и добавьте 500 микролитров свежего DMEM с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина. В качестве варианта на этом этапе добавьте DGJ или DNJ в питательную среду там, где это предназначено.

В день сбора урожая извлеките клетки из инкубатора. Затем аспирируйте среду и с помощью PBS с кальцием и магнием тщательно промойте клетки два раза. Этот шаг имеет решающее значение, потому что DGJ и DNJ являются ингибиторами обоих ферментов, и поэтому любой оставшийся вариант приведет к аннулированию теста.

После промывки добавьте 200 микролитров деионизированной воды непосредственно поверх ячеек. Затем промойте клетки с пластины и перенесите их в реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Поместите образцы в подходящий пенопластовый держатель и переведите их на вихревой поток в течение пяти секунд, чтобы сделать лизис более эффективным.

Затем чередуйте образцы с жидким азотом в течение 10 секунд и водяной баней комнатной температуры до полного оттаивания. Повторив процедуру гомогенизации пять раз, вращайте образцы в течение пяти минут при температуре 10 000 г. Затем переложите надосадочную жидкость в новую реакционную трубку.

Чтобы провести анализ BCA, подготовьте свежую пробирку для каждого образца, содержащую 40 микролитров деионизированного H20, и добавьте 10 микролитров образца. Смешайте каждый раствор путем кратковременного вортекса и перенесите 10 микролитров каждого образца в трех экземплярах в полости 96-луночного планшета. Для приготовления стандартной кривой разведите стоковый раствор BSA из расчета 2 миллиграмма на миллилитр и деионизированный H2O согласно текстовому протоколу.

После объединения реагента А и реагента В начните реакцию, добавив 200 микролитров раствора реагента ВСА, и инкубируйте образцы в темноте при температуре 37 градусов Цельсия и 300 об/мин на орбитальном вибростенде в течение одного часа. Затем измерьте поглощение на 560 нанометрах в планшетном считывателе. Образцы обычно содержат от одного до 1,5 микрограммов белка на микролитр.

Разведите рассчитанное количество каждого образца и разбавьте его пипеткой в свежие реакционные пробирки объемом 1,5 миллилитра до получения 0,05 мкг альфа-галактозидазы А или 0,5 мкг кислоты альфа-глюкозидазы на микролитр раствора. Снова переведите образцы на вихрь в течение пяти секунд и пипеткой в двух экземплярах этого разбавления в 96-луночный планшет. Начните реакцию, добавив 20 микролитров соответствующего раствора субстрата.

Для альфа-галактозидазы А добавьте два миллимоляра 4-метилумбеллиферил альфа-D галактопиранозида или 4-MU-галл в 0,06 молярного фосфат-цитратного буфера, pH 4,7. Для кислотной альфа-глюкозидазы добавьте 2 миллимоляра 4-метилумбеллиферила альфа-D глюкопиранозида или 4-MU-глу в 0,025 молярного ацетата натрия, pH 4,0. Инкубируйте ферментные реакции в течение одного часа в темноте при температуре 37 градусов Цельсия и 300 об/мин на орбитальном шейкере.

Затем завершите реакцию, добавив 200 микролитров 1,0 молярного 10,5-регулируемого буфера гидроксида натрия глицина. Приготовьте стандартную кривую 4-MU из расчета 0,01 мг на миллилитр запаса согласно текстовому протоколу и пипетируйте 10 микролитров растворов в двух экземплярах в 96-луночный планшет. Добавьте 200 микролитров 1,0 молярного буфера глицина гидроксида натрия в каждую лунку, чтобы отрегулировать объем и pH.

Наконец, измерьте активность фермента в флуоресцентном считывателе, оснащенном соответствующим набором фильтров. И проанализировать данные с помощью соответствующего программного обеспечения для устройства флуоресцентного чтения. Для оценки эффективности мутагенеза гена GLA мутагенез мутации были классифицированы на три категории и выявлено, что около 66,5% были получены с первой попытки.

Еще 25% можно получить после немного модифицированной второй ПЦР. В третьей категории необходимо было приложить больше усилий, таких как переработка грунтовки, чтобы получить желаемый клон. В этой таблице приведены результаты измерения активности фермента для трех мутаций альфа-галактозидазы А и трех мутаций альфа-глюкозидазы кислоты, которые остались без лечения или были обработаны с помощью DGJ и DNJ.

Данные отображаются в виде абсолютных значений для оборота субстрата и имеют относительные значения, нормализованные к ферменту дикого типа. Данные об абсолютной активности фермента были скорректированы на эндогенную активность ферментов HEK293H клеток с использованием клеток, трансфицированных пустым вектором pcDNA 3.1. Значения активности фермента были нормализованы до фермента дикого типа из соответствующих экспериментов, что объясняет отклонение относительных значений между различными мутантами.

После освоения фракция постклеточной культуры в этом эксперименте, которая занимает большую часть ручного времени, может быть выполнена в течение четырех часов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области лизосомальных болезней накопления для изучения корреляций генотип-фенотип при болезни Фабри и Помпе. Этот протокол может помочь в разработке новых лекарств для лечения лизосомальных болезней накопления.