Одновременное отображение и количественный Ribonucleotides в митохондриальной ДНК человека

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы составить карту расположения инкорпорированных рибонуклеотидов на уровне разрешения одного нуклеотида и количественно определить количество рибонуклеотидов, присутствующих в митохондриальной ДНК человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся целостности ДНК, механизмов репликации ДНК, механизмов репарации ДНК и того, как дефекты любого из этих механизмов вызывают заболевание. Основное преимущество этого метода заключается в том, что как расположение, так и количество инкорпорированных рибонуклеотидов в митохондриальной ДНК могут быть определены в одном эксперименте.

Хотя этот метод может дать представление о содержании рибонуклеотидов в митохондриальной ДНК человека, он также может быть применен для изучения ядерной ДНК и содержания рибонуклеотидов в последовательных геномах других модельных организмов. В эксперименте используется геномная ДНК, ранее выделенная из клеток HeLa и описанная во втором и третьем разделах текстового протокола. Чтобы переварить ДНК, тщательно перемешайте в микрофуге пробирку.

Один микрограмм ДНК, пять микролитров 10X буфера 3.1, один микролитр HincII и безнуклеазная вода до конечного объема 50 микролитров. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Когда диджест будет завершен, добавьте в каждый образец по 1,8 объема парамагнитных шариков, тщательно перемешанных пипетированием, и выдержите при комнатной температуре в течение 10 минут.

Поместите трубки на магнитную решетку на пять минут, чтобы гранулировать шарики, а затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте гранулу со 150 микролитрами 70% этанола в течение примерно 30 секунд, затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите стирку с 200 микролитрами 70%-ного этанола еще 30 секунд.

Высушите образцы при комнатной температуре в течение примерно 15-20 минут. Далее извлеките трубки из магнитной решетки. Разбавьте каждую гранулу в 45 микролитрах элюирующего буфера, тщательно перемешанного пипетированием, и инкубируйте в течение пяти минут.

Выложите шарики на магнитный штатив, и перенесите 45 микролитров каждого образца ДНК в новую пробирку. К каждым 45 микролитрам выделенной или очищенной ДНК добавьте пять микролитров трех моляров гидроксида калия или пять микролитров трех моляров хлорида калия, создав общий объем в 50 микролитров. Восемь реакций обобщены в этой таблице.

Инкубируйте в гибридизационной печи при температуре 55 градусов Цельсия в течение двух часов, затем инкубируйте образцы на льду в течение пяти минут. Осадите ДНК, добавив 10 микролитров трехмолярного ацетата натрия при pH 5,2, и 125 микролитров холодного, 100% этанола и инкубируйте на льду в течение пяти минут. Гранулируйте ДНК путем центрифугирования при температуре 21 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Выбросьте надосадочную жидкость и промойте каждую гранулу ДНК 250 микролитрами холодного, 70% этанола, снова центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость. Дайте грануле высохнуть в открытой пробирке в течение примерно пяти-10 минут, пока видимая жидкость не испарится. Наконец, добавьте 20 микролитров элюирующего буфера и дайте грануле ДНК раствориться при комнатной температуре в течение 30 минут.

Начните эту процедуру с подготовки реакционной смеси для каждого образца в качестве мастер-смеси. Для каждого образца добавьте 2,5 микролитра 10-кратного реакционного буфера полинуклеотидкиназы Т4, 2,5 микролитра АТФ и один микролитр трех первичных фосфатаз-минус полинуклеотидкиназы Т4. Перенесите 19 микролитров каждого образца ДНК в новую 200-микролитровую пробирку и денатурируйте при температуре 85 градусов Цельсия в термоамплификаторе в течение трех минут.

Затем охладите образцы ДНК на льду, и добавьте в каждый образец шесть микролитров приготовленной реакционной смеси. Инкубируйте реакционные смеси при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, а затем при температуре 65 градусов Цельсия в течение 20 минут, чтобы остановить реакцию. Очистите ДНК с помощью парамагнитных шариков, как было показано ранее, но вымывайте 14 микролитрами элюирующего буфера.

Заранее приготовьте реакционную смесь в качестве мастер-смеси, содержащей следующие данные для каждого образца. Пять микролитров 10x Т4 РНК-лигазы реакционного буфера, пять микролитров гексамминкобальт(III)хлорида, 0,5 микролитра олигонуклеотида ARC140, 0,5 микролитра АТФ и 25 микролитров 50% PEG 8000. Хорошо перемешайте с помощью пипетки.

Перенесите 13 микролитров каждой очищенной ДНК в новую 200-микролитровую пробирку и денатурируйте при температуре 85 градусов Цельсия в термоамплификаторе в течение трех минут. Охладите ДНК на льду, а затем добавьте 36 микролитров реакционной смеси к каждому образцу, перемешайте пипетированием и кратковременно уменьшите. Добавьте по одному микролитру Т4 РНК-лигазы в каждую реакцию, перемешайте с помощью пипетирования и кратковременно замедлите.

Инкубируйте образцы при комнатной температуре в темноте на ночь. Когда лигирование одноцепочечной ДНК будет завершено, очистите ДНК, как было показано ранее, но используйте 0,8 объема парамагнитных шариков и гранулируйте шарики в течение 10 минут. Разбавьте 20 микролитров элюирующего буфера, и перенесите 20 микролитров каждого образца ДНК в новую пробирку объемом 200 микролитров.

Повторите очистку с 0,8 объемами парамагнитных шариков, и разбавьте 14 микролитрами элюирующего буфера. Для каждого образца готовят реакционную смесь в виде мастер-смеси, состоящей из двух микролитров 10x T7 реакционного буфера ДНК-полимеразы, двух микролитров ARC76/77, двух микролитров dNTP и 0,8 микролитров BSA. Перенесите 12,8 микролитров очищенной ДНК в новую пробирку объемом 200 микролитров и денатурируйте при температуре 85 градусов Цельсия в термоамплификаторе в течение трех минут.

Охладите ДНК на льду, а затем добавьте 6,8 микролитров реакционной смеси к каждому образцу, перемешайте пипетированием, кратковременно открутите и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Добавьте 0,4 микролитра ДНК-полимеразы Т7 в каждую реакцию и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. После очистки ДНК с помощью парамагнитных шариков разбавьте 11 микролитров элюирующего буфера.

Чтобы начать амплификацию ПЦР, приготовьте реакционную смесь отдельно для каждого образца в новой пробирке объемом 200 микролитров, состоящей из 7,5 микролитров ARC49, 7,5 микролитров праймера с уникальным индексом и 25 микролитров готовой смеси 2X для горячего старта. Добавляйте по 10 микролитров образца ДНК в каждую реакцию. Расширьте библиотеку, используя следующие условия.

Денатурация при температуре 95 градусов Цельсия в течение 45 секунд, затем 18 циклов при температуре 98 градусов Цельсия в течение 15 секунд, 65 градусов Цельсия в течение 30 секунд, 72 градуса Цельсия в течение 30 секунд и, наконец, окончательное удлинение при температуре 72 градуса Цельсия в течение двух минут. Держите образцы при температуре четыре градуса Цельсия после усиления. Очистите библиотеки, как описано в текстовом протоколе, и разбавьте 20 микролитров TE-буфера.

Определите качество и средний размер фрагментов каждой библиотеки с помощью цифровой системы электрофореза. Приведены репрезентативные результаты подходящих библиотечных профилей после обработки гидроксидом калия или хлоридом калия. После вычисления концентрации каждой библиотеки извлеките равные молярные количества до 24 библиотек, амплифицированных различными индексными праймерами для секвенирования, как описано в разделах 9 и 10 текстового протокола.

Добавьте TE буфер до конечного объема 25 микролитров и концентрации 10 наномоляров. После секвенирования выполните биоинформатический анализ данных, как указано в разделе 11 текстового протокола. Эти графики показывают обобщенные чтения на всех сайтах HincII в легкой и тяжелой цепи митохондриальной ДНК человека после обработки хлоридом калия.

Около 70% из всех обнаруженных пяти прайм-эндов локализованы в местах разреза, что свидетельствует о высокой эффективности разложения HincII. Обработка библиотек гидроксидом калия для гидролиза ДНК на встроенных рибонуклеотидах снижает количество прочтений в HincII примерно до 40%Относительное количество прочтений в митохондриальной и ядерной ДНК выявляет различия в покрытии и иллюстрирует важность соответствующей нормализации для устранения смещения цепи. Нормализация количества прочтений до HincII дает количественную меру количества рибонуклеотидов в митохондриальном геноме на тяжелой или легкой цепи.

Прочтения после обработки гидроксидом калия для каждого рибонуклеотида, нормализованные в соответствии с последовательным составом каждой цепи, показывают соотношение, отличное от единицы, что указывает на неслучайное распределение прочтений и предполагает четкую структуру рибонуклеотидов и высокое качество библиотеки. Нормализация прочтений в сайтах встроенных рибонуклеотидов до таковых в сайтах HincII, а также в геноме нуклеотидов позволяет получить количественную меру того, сколько каждого рибонуклеотида включено на 1000 комплементарных оснований. После освоения этого протокола его можно выполнить за два дня, если он выполняется правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что ДНК должна быть в хорошем состоянии и не допускать каких-либо двухцепочечных разрывов во время подготовки библиотеки. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы для подтверждения данных количественного определения рибонуклеотидов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как подготовить библиотеки для картирования и количественной оценки рибонуклеотидов и ДНК с помощью секвенирования нового поколения.

Не забывайте, что работа с химическими веществами, такими как гидроксид калия, может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защиты глаз и перчаток.