Визуализация Thalamocortical аксона ветвления и синапса формирования в Organotypic Cocultures
28 марта 2018 г.
Этот протокол описывает метод для одновременной обработки изображений thalamocortical аксона ветвления и СИНАПС формирования в organotypic cocultures таламуса и коры головного мозга. Аксоны отдельных thalamocortical и их Пресинаптический терминалы визуализируются путем электропорации техника одной ячейки с DsRed и synaptophysin GFP-тегами.
Общей целью данного метода является изучение динамических морфологических изменений ветвления аксонов и формирования синапсов в таламокортикальной проекции. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, такие как формирование новых нейронных цепей. Основным преимуществом этой методики является одновременное наблюдение за ростом аксонов и образованием синапсов в отдельных живых клетках.
Этот метод может дать представление о взаимосвязи между ветвлением аксонов и формированием синапсов в таламокортикальных проекциях. Он также может быть применен к другим нейронным цепям, таким как внутренняя связь в коре головного мозга. Чтобы начать эту процедуру, стерилизуйте все хирургические инструменты с 70% этанолом в течение 10 минут или дольше.
Затем быстро препарируйте весь мозг крысы после рождения на второй день под ледяной анестезией. Затем поместите мозг в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 40 миллилитров холодного сбалансированного раствора соли Хэнка. Под бинокулярным микроскопом осторожно удалите вещество пиа тонкими щипцами и разрежьте первичную зрительную и соматосенсорную кору на срезы толщиной от 300 до 400 микрон с помощью микрохирургических ножниц.
После этого переложите кортикальные срезы на мембранный фильтр культурального вкладыша с помощью одноразовой пластиковой пипетки. Отрегулируйте положение ломтиков возле центра вкладыша для культуры с помощью одноразовой пластиковой пипетки и удалите излишки среды из вкладыша. Поддерживайте срезы в питательной среде, содержащей сыворотку, при температуре 37 градусов Цельсия и культивируйте их отдельно в течение одного дня, прежде чем поместить рядом с ним таламический блок из эмбриона Е15.
Отрегулируйте уровень среды немного ниже поверхности ломтика, чтобы ломтики могли получать достаточную подачу как газа, так и среды. Это имеет решающее значение для жизнеспособности ломтиков. На этом этапе сделайте стеклянные капилляры с помощью электродного съемника.
Затем разбить кончики стеклянных капилляров для введения плазмиды. Для электродных пипеток отшлифуйте и отполируйте кончики стеклянных капилляров наждачной бумагой. А затем отполируйте их огнём до достижения внутреннего диаметра от 50 до 200 микрон.
Далее подсоедините электродную пипетку и выталкивающую пипетку к манипуляторам. Перелейте пять микролитров раствора плазмиды в чашку Петри. Затем наберите раствор в электродную пипетку с капиллярным действием.
Вставьте электрод диаметром 0,2 миллиметра в электродную пипетку. После подключения эжекционной пипетки к одномиллилитровому шприцу с пластиковой трубкой снова переложите пять микролитров раствора плазмиды в чашку Петри. Затем медленно наберите раствор в эжекционную пипетку с помощью шприца.
После этого перенесите кокультуру на стадию электропорации и вставьте электрод диаметром один миллиметр в питательную среду. Затем поместите выталкивающую пипетку на культивируемый таламический блок. Толкайте шприц вручную после того, как наконечник коснется поверхности таламического блока.
Поместите электродную пипетку на таламический блок сразу после втягивания выталкивающей пипетки. Теперь подайте электрические импульсы. Следите за амплитудой и количеством поездов на осциллографе.
После этого втяните электродную пипетку и верните чашку в инкубатор. Для наблюдения за образцом поместите чашку для культивирования на предметное столико вертикального конфокального микроскопа, оснащенного двумя наборами фильтров для EGFP и DsRed. Затем сделайте снимки от 10 до 25 оптических сечений с шагом от одного до семи микрон с помощью объектива с 20-кратным рабочим расстоянием.
Выберите индивидуально различимые меченые аксоны, которые выражают как DsRed, так и Syp-EGFP. Здесь показана органотипическая кокультура таламических и кортикальных срезов после 12 DIV. Вот увеличенное изображение области в рамке.
А вот таламическая клетка, меченная DsRed, простирается аксоном в кортикальный срез и образует ветви в верхних слоях. На этих изображениях показан таламокортикальный аксон, меченный DsRed, и точка Syp-EGFP. Дискретное накопление Syp-EGFP наблюдалось вдоль одного таламокортикального аксона.
DsRed плюс Syp-EGFP плазмиды вводили в культивируемые таламические клетки в одном DIV с помощью электропорации. Этот аксон визуализировался ежедневно в течение четырех дней. Ветвление аксонов и образование синапсов были динамическими, с присоединением и элиминацией.
После этих процедур можно провести электропорацию с интересными генами вместе с Syp-EGFP и DsRed с целью исследования роли гена в ветвлении аксонов и формировании синапсов. Этот метод открывает исследователям в области нейробиологии путь к изучению механизмов динамических изменений нейронных цепей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол одновременной визуализации ветвления таламокортикальных аксонов и формирования синапсов в органотипических кокультурах таламуса и коры головного мозга. Основное внимание уделяется динамическим морфологическим изменениям в таламокортикальной проекции, что позволяет получить представление о формировании новых нейронных цепей и взаимосвязи между ростом аксонов и развитием синапсов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Нейробиология
- Клеточная биология
Теоретические сведения
- Таламокортикальные проекции играют критическую роль в обработке сенсорной информации.
- Понимание процессов ветвления аксонов и формирования синапсов необходимо для изучения принципов построения нейронных цепей.
- Существующие методы имеют ограничения при одновременном наблюдении за этими изменениями на клеточном уровне.
- Данное исследование совершенствует методы визуализации в контексте живых клеток.
Цель исследования
- Исследование динамических морфологических изменений в процессе ветвления аксонов и формирования синапсов.
- Предоставление метода, позволяющего наблюдать за отдельными живыми клетками в кокультуре.
- Оценка взаимосвязи между ростом аксонов и развитием синапсов в таламокортикальных нейронах.
Используемые методы
- Были использованы органотипические кокультуры срезов таламуса и коры головного мозга.
- Для создания биологической модели использовались ткани крыс второго постнатального дня.
- Для введения флуоресцентных маркеров с целью визуализации была проведена электропорация.
- Культуры поддерживали при температуре 37 °C и наблюдали в определенные временные точки развития.
- Визуализация динамики аксонов осуществлялась с помощью конфокального микроскопа.
Основные результаты
- Наблюдались динамические изменения в ветвлении аксонов и формировании синапсов, что подчеркивает пластичность таламокортикальных проекций.
- Отмечалось дискретное накопление синаптических маркеров вдоль аксонов, что указывает на продолжающееся развитие синапсов.
- Данный метод позволил в режиме реального времени наблюдать за морфологическими изменениями в отдельных клетках.
- Результаты подчеркивают возможность исследования роли генов в динамике аксонов и синапсов.
Выводы
- В данном исследовании представлен новый метод изучения динамики и пластичности нейронных цепей.
- Оно позволяет понять взаимосвязь между ростом аксонов и формированием синапсов.
- Полученные результаты имеют значение для понимания механизмов нейронной связности и пластичности при нормальном состоянии и при патологиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод позволяет одновременно визуализировать ветвление аксонов и формирование синапсов в живых нейронных цепях, устраняя ключевой пробел в понимании механизмов при валидации нейроdevelopmentальных мишеней. Предоставляя динамические данные о структурной пластичности с разрешением до одной клетки, он повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска, когда критически важно снижение механистических рисков для синаптических мишеней. Данный подход обеспечивает трансляционную преемственность — от понимания механизмов до доклинической оценки фенотипов на уровне нейронных цепей в моделях нейропсихиатрических заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишеней
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывающие морфологию аксонов с синаптической связностью в таламокортикальных путях.
- Практическая ценность: сохраняет ламинарную архитектуру и жизнеспособность нейронов для лонгитюдного наблюдения за динамическими структурными изменениями.
- Научная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет уточнения причинно-следственных связей между структурным ростом и функциональным синаптогенезом.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные мультиплексные показатели аксонального ветвления и накопления пресинаптических маркеров для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: Позволяет подготавливать валидированные биологические системы для последующего скрининга соединений в путях нейроразвития.
- Практическая ценность: Обеспечивает масштабируемые и воспроизводимые рабочие процессы визуализации, совместимые с мультиплексными флуоресцентными показателями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Соответствует системам, связанным с заболеваниями, при которых таламокортикальная дисконнективность способствует формированию сенсорных и когнитивных фенотипов.
- Практическая ценность: Обеспечивает непрерывный переход от этапа механистического скрининга при поиске к доклинической валидации восстановления на уровне нейронных цепей.
- Научная ценность: Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков, связывая структурную динамику с функциональными синаптическими результатами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего этапа поиска новых лекарств, позволяя напрямую наблюдать структурную пластичность, предшествующую показателям функционального анализа в моделях нейронных цепей.
- Открытия в биологии: Обеспечивает проверку гипотез о генах, регулирующих динамику ветвления аксонов и формирование синаптических сайтов в живых цепях.
- Скрининг: Предоставляет готовые к анализу количественные данные о морфологии и флуоресцентных пунктах для профилирования эффектов соединений.
- Аналитика: Позволяет проводить статистическое сравнение частоты ветвления и плотности синапсов в различных экспериментальных условиях с течением времени.
- Трансляционные исследования: Связывает механистические выводы с доклиническими моделями нарушений нейроразвития, характеризующихся изменениями таламокортикальных путей.
- Повторное использование в организации: Создает многократно используемую платформу визуализации для многопараметрической оценки нейритогенеза и синаптогенеза в различных нейронных моделях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет уменьшения неопределенности в соотношении «структура — функция» при сборке нейронных цепей.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы двухканальной визуализации для последовательного лонгитюдного отслеживания аксональной и синаптической динамики.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя механистические доказательства взаимодействия мишени с путями структурной пластичности.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе подтвержденного воздействия на связь аксон-синапс в функционально значимых цепях человека.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с поддержанием органотипических кокультур, электропорацией и конфокальной микроскопией.
- Эффективность трансфекции зависит от стерильности хирургического инструментария, качества подготовки микропипеток и чистоты плазмидной ДНК.
- Для сохранения жизнеспособности срезов в течение нескольких дней необходим контроль температуры среды при 37°C и использование среды с добавлением сыворотки.
- Адаптация метода для других нейронных цепей требует проверки совместимости тканей и эффективности электропорации.
- Практические ограничения включают вариабельность эффективности трансфекции и необходимость проведения последующего анализа изображений для количественной оценки ветвления и динамики пунктат.
