3D митохондриальной Ультраструктура дрозофилы косвенные полет мышцы показали серийный Секция электрон томография

Общая цель этого видео — определить применение электронной томографии с последовательным срезом для изучения митохондриальной ультраструктуры непрямой летной мускулатуры дрозофилы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области структурной клеточной биологии, такие как структура и функциональное отношение к митохондриям. Основное преимущество этой методики заключается в том, что клеточная ультраструктура раскрывается в трех измерениях.

Чтобы начать эксперимент, обезболите пять образцов дрософолы на льду и погрузите каждую муху в один миллилитр агарозы с низким содержанием таяния 4% в фосфатном буфере. Дайте агарозе застыть на льду. Затем с помощью микротома с вибрирующим лезвием разрежьте дрософолу, залитую агарозным гелем, на ломтики толщиной 100 микрометров.

Погрузите ломтики в фиксирующий раствор, содержащий 2,5% глутаральдегида в ноль одной молярной фосфатной буферной единицы. Промойте участки ткани в трех каплях фосфатного буфера, затем промойте двумя каплями фосфатного буфера с 20% BSA. Поместите секции в золотые держатели для замораживания под высоким давлением, или HPF, заполненные буфером и 20% BSA.

Затем загрузите образец, содержащий носители, в морозильную камеру высокого давления в соответствии с инструкцией пользователя. После замораживания освободите носители от держателя под жидким азотом и перенесите их в устройство свободной замены, охлажденное до отрицательных 140 градусов Цельсия. Выполните протокол свободного замещения коктейлем FS, содержащим 2% глутаральдегида, 2% тетраоксида осмия, 0,1% уранилацетата в ацетоне.

Заделите образцы в смолу при комнатной температуре. Затем полимеризуйте смолу при температуре 65 градусов Цельсия в течение 16 часов. Обрежьте блоки образцов, чтобы обнажить нужную грань блока, содержащую ткань.

Затем предварительно обработайте 10-нанометровые частицы золота 1% BSA в течение 30 минут. Промойте и суспензируйте частицы золота в фосфатно-солевом буфере или PBS. Наложите частицы золота на медные сетки предметного стекла, покрытые углеродной пленкой, чтобы создать реперные маркеры.

Резка серийных участков толщиной от 200 до 250 нанометров с помощью ультрамикротома. Затем соберите последовательные секции на решетках слотов с помощью идеальной петли для тонких секций. Окрашивайте срезы цитратом свинца Рейнольдса в течение 10 минут.

Поверх секций наложите второй слой частиц реперного золота. Загрузите сетку на двухосевой держатель томографа и вставьте в просвечивающий электронный микроскоп, работающий под напряжением 200 киловольт. Выровняйте микроскоп по эуцентрическому фокусу.

Настройте программное обеспечение для автоматического сбора данных, настройте и выровняйте электронный пучок при настройке многомасштабного изображения, получите темные и яркие эталоны камеры в пустой области без углеродной пленки при настройке сбора томографа. Далее соберите атлас сетки при малом увеличении. Выберите митохондрии на серийных срезах в качестве мишеней для сбора томографии, получите ряд наклонов от отрицательных 60 градусов до положительных 60 градусов с шагом в два градуса по оси А для каждой мишени.

Наконец, соберите вторую серию наклонов. Поверните держатель образца на 90 градусов. Приобретите новый атлас.

Выберите соответствующие положения и получите ряд наклонов по оси B для каждой цели. С помощью этого метода были получены 2-D микрофотографии и 3-D томографы из серийных срезов, охватывающих весь объем митохондрии. Соединенные томограммы серийного сечения проецируются таким образом, чтобы создать продольный разрез с вертикальной осью z.

помощью серийной срезовой электронной томографии были проанализированы структурные особенности митохондриальных кристаллов, отражающие их энергетическое состояние и старение. Срезы митохондриальных электронно-томографических реконструкций выявляют переключения между пластинчатыми мембранами по оси z. Томографическая сегментация, иллюстрирующая левостороннюю спираль в 3D.

Были проанализированы шаблоны переключения кристаллов и отрисованы цвета на модели сегментации. Томографический срез показывает слияние латерального матрикса через мембраны кристаллов. Была сгенерирована модель сегментации томограммы, показывающая слияние латерального матрикса и репрезентативные кристы.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить электронную томографию с последовательным срезом, которая может быть адаптирована для изучения любой клеточной структуры в трех измерениях.