Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay
12 марта 2018 г.
Этот протокол описывает пробирного Перевернутый вертикальных вторжения, которые могут использоваться для количественного определения миграции и вторжения возможности клеток в трехмерное обстановке при сохранении микроокружения клеток. Этот assay подходит для редких и/или чувствительных клеток.
Общая цель этого анализа инвазии заключается в количественной оценке миграционных и инвазивных способностей редких и чувствительных клеток в 3D-условиях без вытеснения клеток из их микроокружения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований рака о способности к инвазии чувствительных и олучевых событий, таких как продукт слияния раковых клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что клетки анализируются в их исходном микроокружении с использованием 3D-настроек.
Применение этого метода распространяется и на терапию рака, поскольку он может быть использован для скрининга фармакологических агентов, способных ингибировать инвазию и метастазирование раковых клеток. Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение. Аспирация температуры и pH коллагеновой смеси влияет на ее полимеризацию, а грубое обращение приводит к отслоению геля.
Начните с обработки 35-миллиметровой чашки для культуры с 10-миллиметровым стеклянным дном лунки одним миллилитром одной молярной соляной кислоты, чтобы снизить гидрофобность стекла. Через 15 минут вымойте тарелку два раза одним миллилитром PBS за одну стирку, а затем одну промывку одним миллилитром 70% этанола. Затем промойте планшет одним миллилитром питательной среды, специфичной для используемых клеток.
И засейте тарелку интересующими вас клетками. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. Когда клетки достигнут 100% конфлюенции, соедините 114,5 микролитров свежеприготовленного коллагена крысиного хвоста, 16,6 микролитров среды 10 X DMEM и 33,1 микролитра питательной среды с добавлением интересующего вас химиоаттрактанта в микроцентрифужной пробирке на льду.
Нейтрализуйте коллагеновую смесь 14 микролитрами гидрокарбоната натрия и покройте клетки 80 микролитрами геля. Дайте коллагену полимеризоваться во влажном 37 градусах Цельсия и пятипроцентном углекислом бассейне в течение 30 минут. Затем нанесите два миллилитра восстановленной двухпроцентной среды для культивирования клеток сыворотки крови на гель и осторожно верните клетки в инкубатор на соответствующий экспериментальный период времени, не вытесняя коллаген.
По окончании инкубации аккуратно извлеките среду и тщательно промойте гель одним миллилитром PBS. Зафиксируйте ячейки одним миллилитром четырехпроцентного параформальдегида на 15 минут с последующим двумя промывками в одном миллилитре PBS на одну промывку. Затем пометьте клетки раствором DAPI в течение 20 минут при комнатной температуре и визуализируйте трехмерную инвазию коллагена in vitro с помощью конфокальной микроскопии.
Здесь показана количественная оценка инвазии коллагенового геля линией клеток рака молочной железы и продуктами слияния клеток рака молочной железы в ответ на химиоаттрактант в течение 48-часового периода миграции. Примечательно, что также наблюдалась миграция редких продуктов слияния клеток рака молочной железы в коллагеновый гель в ответ на химиоаттрактант. Клетки остаются здоровыми на протяжении всего эксперимента с коллагеновым гелем, о чем свидетельствует поддержание в них устойчивого количества клеток и их морфологии в течение 48 часов после полимеризации гелем.
Этот вертикальный анализ коллагенового геля также позволяет анализировать кинетику миграции клеток при инвазии путем визуализации миграции клеток в Z-серии, а также морфологию мигрирующих клеток, которые должны быть захвачены in situ. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что нужно использовать чашку для посева, совместимую с вашим микроскопом. После этой процедуры могут быть введены другие переменные, такие как изменение силы коллагена или использование различных химиоаттрактантов, чтобы ответить на дополнительные вопросы о влиянии вовлечения ВКМ на клеточную инвазию или о влиянии различных химиоаттрактантов на клеточную инвазию, соответственно.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии и рака к скринингу фармакологических ингибиторов метастазирования, а также к изучению заживления ран при всех воспалительных реакциях in vivo. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как оценить миграционную и инвазивную способность редких и чувствительных клеток в 3D-условиях, не искажая клетки при микрововлечении. Не забывайте, что ходьба с раковыми клетками человека, соляной кислотой, параформальдегидом и DAPI может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование биосептического шкафа номер два и удержание дыма.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод инвертированного вертикального анализа инвазии, который позволяет количественно оценить миграционную и инвазирующую способность редких и чувствительных клеток в трехмерных условиях при сохранении клеточного микроокружения. Этот метод особенно актуален для исследований в области онкологии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Миграция клеток
- Исследование рака
- Анализы на инвазию
Введение
- Данный анализ позволяет исследовать клетки в их исходном микроокружении.
- Метод разработан для работы с редкими и чувствительными клетками.
- Понимание механизмов клеточной инвазии имеет решающее значение для разработки методов терапии рака.
- Визуальная демонстрация методики необходима для ее правильного выполнения.
Цель исследования
- Для количественной оценки миграционной и инвазивной способности клеток.
- Для изучения способности к инвазии чувствительных клеток.
- Для скрининга фармакологических агентов, ингибирующих инвазию и метастазирование раковых клеток.
Используемые методы
- Инвертированный анализ вертикальной инвазии
- Трехмерное культивирование клеток
- Анализ клеток в их микроокружении
- Оценка влияния температуры и pH на полимеризацию коллагена
Основные результаты
- Продемонстрирована возможность анализа поведения клеток в трехмерной среде.
- Подчеркнута важность поддержания микроокружения клеток.
- Получены данные об инвазивных способностях раковых клеток.
- Показан потенциал для скрининга терапевтических агентов.
Выводы
- Данный анализ является ценным инструментом для исследований рака.
- Он позволяет сохранить микроокружение чувствительных клеток.
- Может помочь в разработке методов терапии, направленных на борьбу с инвазией и метастазированием раковых опухолей.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Данный анализ позволяет научно-исследовательским группам в области биофармацевтики оценивать инвазивный потенциал редких и чувствительных клеточных моделей в физиологически релевантной 3D-микросреде без нарушения естественных взаимодействий между клетками и внеклеточным матриксом (ВКМ). Благодаря сохранению исходной клеточной ниши данный метод способствует механистическому снижению рисков при работе с мишенями, связанными с метастазированием, и повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней на ранних этапах. Он восполняет критический пробел в доклиническом скрининге, где традиционные методы анализа нарушают целостность микросреды, тем самым обеспечивая трансляционную преемственность от этапа поиска до оптимизации ведущих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем оценки инвазии в редких клеточных моделях или моделях на основе слитных генов в нативных условиях микроокружения.
- Практическая ценность: снижает артефактную вариабельность, вызванную смещением клеток, что повышает воспроизводимость фенотипов инвазии в различных экспериментах.
- Прогностическая ценность: способствует снижению рисков при выборе терапевтических мишеней, связывая молекулярные изменения с функциональными результатами инвазии в 3D-контексте.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать стандартизированные количественные показатели инвазии, совместимые с высокопроизводительным имиджингом и автоматизированными рабочими процессами анализа.
- Воспроизводимость: минимизирует вариабельность между лунками за счет исключения механического повреждения клеиных слоев при подготовке анализа.
- Масштабируемость: совместимость с различными концентрациями коллагена и хемоаттрактантами позволяет проводить исследования зависимости «структура — активность» (SAR) для ингибиторов метастазирования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: моделирование инвазии рака человека с использованием гибридных фибробластно-эпителиальных клеток, отражающих стромально-опухолевые взаимодействия in vivo.
- Трансляционная преемственность: обеспечение перехода от результатов in vitro к доклинической валидации за счет сохранения микроокружения, имеющего критическое значение для инвазивного поведения.
- Принятие решений с учетом рисков: получение функциональных данных об инвазии для приоритизации мишеней или соединений, что снижает вероятность неудач на поздних этапах из-за некорректного моделирования микроокружения.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум первичных исследований — от ранней валидации мишени до идентификации ведущего соединения, предлагая альтернативу камерам Бойдена или трансвелл-системам с сохранением микроокружения для программ по изучению метастазирования.
- Поисковая биология: обеспечивает проверку гипотез о путях инвазии за счет возможности получения z-стекового изображений миграции клеток в физиологических коллагеновых гелях в режиме реального времени.
- Скрининг: предоставляет конечные данные об инвазии, подходящие для скрининга библиотек соединений, особенно для агентов, воздействующих на ремоделирование ECM или хемотаксическую сигнализацию.
- Аналитика: позволяет количественно определить число инвазивных клеток и провести морфометрический анализ, обеспечивая многопараметрические показатели для корреляции структуры и функции.
- Трансляционные исследования: моделирует стромально-опосредованную инвазию с использованием гибридов MSC-рак, что способствует проведению механистических исследований, связанных с биомаркерами.
- Повторное использование в масштабах предприятия: adaptable для различных типов рака и стромальных кокультур, что способствует повторному использованию платформы в программах по изучению метастазирования и заживления ран.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет снижения количества ложноположительных результатов, вызванных нарушением микроокружения.
- Практическая ценность: Повышает воспроизводимость анализа благодаря стандартизированным протоколам полимеризации геля и наложения слоев.
- Стратегическая ценность: Улучшает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя физиологически релевантные данные об инвазии на ранних этапах процесса.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет осуществлять риск-стратифицированное продвижение ингибиторов метастазирования на основе функциональных профилей 3D-инвазии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с трехмерными (3D) клеточными культурами и конфокальной микроскопией для точной количественной оценки инвазии.
- Зависит от точного контроля температуры и pH при подготовке коллагена для обеспечения стабильной полимеризации геля.
- Необходимо стандартизировать дозировку хемоаттрактанта и использовать среду с пониженным содержанием сыворотки для воспроизводимости хемотаксического ответа.
- При переходе на альтернативные белки внеклеточного матрикса (например, Matrigel, фибрин) может потребоваться оптимизация кинетики гелеобразования и концентрации.
- Метод ограничен адгезивными или полуадгезивными клетками, способными к инвазии вверх через слой геля; для неадгезивных суспензий могут потребоваться модификации.
