Объектив Бесплатные видео микроскопии для динамического и количественный анализ культуры адэрентных клеток

Общая цель данной методики заключается в получении и анализе динамики большой популяции адгезивных клеток, контролируемых с помощью безлинзовой видеомикроскопии. Таким образом, мы считаем, что этот метод интересен во многих областях биологии, а также для изучения клеточной пролиферации или клеточного цистита, или скрининга лекарств, или мониторинга различных биопроцессов. Таким образом, эта техника не требует меток и очень проста.

Но он очень эффективен при изучении больших клеточных популяций. Какая идея для этого метода, когда мы перешли от области обнаружения бактерий к области визуализации клеток млекопитающих. Тогда было полезно, что биологу, им понадобится покадровая съемка контура непосредственно в инкубатор.

Затем мы создали специальный безлинзовый видеомикроскоп, совместимый с инкубатором, и разработали алгоритм голографической реконструкции, чтобы получить изображение тысяч клеток, присутствующих в очень большом поле зрения. Начните эту процедуру с покрытия 6 лунок стеклянной нижней пластины фибронектином при комнатной температуре на 1 час. Через 1 час удалите излишки фибронектина и прополощите 6 лунок стеклянной нижней пластиной с PBS.

В этой демонстрации используются клетки Hela, выращенные в DMEM, плюс глутамин, дополненные 10%-ным теплом в активированной эмбриональной сыворотке телят, а также 1%-ным пенициллином и стрептомицином. Засейте двадцать тысяч клеток на культуральную пластину. Важно использовать емкость со стеклянным дном.

За качество безлинзового приобретения. Поместите планшет с культурой в инкубатор поверх безлинзового видеомикроскопа. Безлинзовый видеомикроскоп, используемый для этой покадровой съемки, доступен в продаже.

Он оснащен полупроводниковым датчиком изображения на основе оксида металла с областью изображения 29,4 квадратных миллиметра и шагом пикселя 1,67 микрометра. Многоволновое освещение обеспечивается многокристальным светоизлучающим диодным устройством, расположенным над отверстием размером 150 микрометров на расстоянии примерно 5 сантиметров от ячеек. Прежде чем начать покадровую съемку, важно убедиться, что на крышке нет конденсата.

Потому что конденсация ухудшит качество получаемого изображения. Если на крышке тарелки образовался конденсат, очистите крышку. Управляйте видеомикроскопом без линз с помощью коммерчески доступного программного обеспечения для сбора данных.

Который выполняет как покадровую съемку, так и голографическую реконструкцию. Введите необходимые входные параметры в интерфейсе программы. Установите частоту кадров на 1 сбор каждые 10 минут, тип клеточной культуры на адгезивный и продолжительность эксперимента на 3 дня.

Запустите покадровую съемку. На этом изображении показан пример полного поля зрения необработанного снимка в синем канале на площади 29,4 квадратного миллиметра в одном кадре. Панель B является деталью панели A, а панель C — деталью панели B. Алгоритм голографической реконструкции автоматически обрабатывает получение данных без линз для получения фазового изображения клеточной культуры.

Показан пример изображения ячеек до развертки фазы, за которым следует изображение после фазовой развертки. Отслеживание клеток осуществляется с помощью алгоритма TrackMate, плагина с открытым исходным кодом для автоматического отслеживания отдельных частиц. После загрузки, полного покадрового сбора данных на Фиджи и настройки алгоритмов, как описано в текстовом протоколе, установите входные параметры.

Установите предполагаемый диаметр большого двоичного объекта равным 15 пикселям, пороговое значение детектора — 0,25, максимальное расстояние связывания — 15 пикселям, максимальное расстояние закрытия разрыва — 15 пикселям, а количество пятен в треке — 3,5. Первым шагом в алгоритме слежения за клетками является обнаружение клеток при безлинзовом сканировании. Отображаются результаты алгоритма слежения за ячейками, причем все треки ячеек отображаются на протяжении пятидесяти кадров, или около 8 часов.

С цветовым кодом, соответствующим медианной скорости. Нижняя панель представляет собой детализированное изображение желтого прямоугольника с верхней панели. Здесь показан репрезентативный видеоклип с отслеживанием сотовой связи.

В конце процесса отслеживания ячеек нажмите кнопку анализа, чтобы сгенерировать результаты в виде 3 текстовых файлов. На основе этих данных выполнить сегментацию клеток и обнаружить деления клеток с помощью специальных алгоритмов, как подробно описано в текстовом протоколе и дополнительных файлах кода. Компиляция всех измерений отдельных ячеек по полной покадровой съемке позволяет получить точечные диаграммы нескольких метрик в зависимости от времени.

Общее количество клеток в полном поле зрения, увеличивается с двух тысяч до пятнадцати тысяч за 2,7 дня. Умноженное на количество временных точек, это приводит к большому набору данных обнаруженных ячеек. Каждый из них характеризуется своими координатами и морфологическими особенностями, такими как сухая масса, площадь, средняя толщина, основная длина доступа и соотношение сторон.

Комбинация алгоритмов отслеживания и сегментации клеток позволяет проводить кинетические измерения на уровне отдельных клеток. В этом примере показан анализ клеточной дорожки продолжительностью около 66 часов и демонстрацией 4 делений клеток в точках времени, обведенных желтым цветом. Несколько метрик были рассчитаны как функция времени: площадь поверхности клетки, сухая масса, средняя толщина и подвижность клеток.

Распределение длительности клеточного цикла при наблюдении за 2,7 сутками было близко к агузианскому. В среднем 16,5 часов. Длины клеточных циклов, измеряемые автоматически, хорошо коррелируют с длинами клеточных циклов, измеренными вручную.

Были изучены и другие параметры, такие как начальная сухая масса клетки, конечная сухая масса и средняя скорость роста в течение клеточного цикла. После освоения полного анализа данных покадровой съемки можно выполнить за несколько часов, в зависимости от конфигурации процессора и производительности оборудования. При проведении этой процедуры очень важно тщательно измерить начальную концентрацию клеток.

Если начальная концентрация клеток слишком велика, алгоритм отслеживания клеток не сможет правильно определить траектории клеток. Но, если концентрация клеток слишком низкая, статистика полного анализа также будет слишком низкой. Следуя этой процедуре, можно выполнить автоматизированный анализ, похожий на анализ отслеживания клеток, чтобы ответить на другие вопросы в областях: биология, фундаментальная биология или хемотаксис.

Этот новый метод также прокладывает путь к мониторингу клеточной линии, который, как мы надеемся, принесет интересное понимание для изучения клеточного цикла. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить покадровую съемку с помощью безлинзовой видеомикроскопии и как анализировать большую популяцию клеток.