Ищет пути водитель приобрела устойчивость к таргетной терапии: лекарственно Subclone поколения и чувствительность, восстановление генов нокдаун

Общая цель этой доклинической платформы состоит в том, чтобы обеспечить стандартную процедуру для идентификации и характеристики механизмов, вызывающих приобретенную устойчивость к таргетной терапии. Этот метод может помочь реализовать геномный драйв в онкологии, в частности, решить ключевые вопросы о гетерогенности опухоли и множественных механизмах, ответственных за приобретенную резистентность к таргетной терапии. Основным преимуществом этой методики является эффективный по времени и с точки зрения затрат затраты, что позволяет in vitro исследовать механизмы резистентности к таргетной терапии.

Применение этого метода распространяется и на терапию рака, поскольку сопротивление легких все еще является проблемой для новых таргетных методов лечения. Этот метод может дать представление о механизме, связанном с резистентностью к таргетной терапии, но он также может быть использован для изучения эффективности традиционных химиотерапевтических средств. Как правило, операторы, использующие этот метод, будут иметь дело с поколением устойчивых к лекарствам субклонов, что наиболее трудно для стандартизации.

Впервые идея этого метода возникла у нас, когда мы охарактеризовали приобретенный механизм резистентности к трастузумабу в HER-положительных клеточных линиях рака желудка. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку для создания и валидации моделей лекарственной устойчивости in vitro требуется несколько методов, включая восстановление чувствительности путем нокдауна генов. Чтобы начать эту процедуру, посейте клетки NCI N87 в колбы для культур площадью 25 квадратных сантиметров.

Добавьте 10 мкг на миллилитр трастузумаба в питательную среду в каждой колбе. Подвергайте клетки воздействию этой начальной дозы до тех пор, пока они не возобновят рост. После того, как рост клеток возобновится примерно через две недели, подвергните клетки воздействию трастузумаба в концентрации 100 микрограммов на миллилитр.

Продолжайте постепенно увеличивать концентрацию трастузумаба, ожидая, пока клетки возобновят рост перед каждым воздействием, пока не будет достигнута концентрация 400 мкг на миллилитр. Клеточная линия может проявлять различную чувствительность к различным лекарственным препаратам. Одним из решений этой проблемы является воздействие на клетки постепенно увеличивающихся доз лекарств, начиная с дозы, примерно в десять раз превышающей пиковую концентрацию в плазме в час, до тех пор, пока клетки не продолжат расти.

Далее засеиваем клетки в 24 многолуночные культуральные планшеты. Подвергайте засеянные клетки повышению концентрации ингибитора целевой терапии со 100 мкг на миллилитр до 400 мкг на миллилитр. Инкубировать в CO2-инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 дней.

После этого удалите среду и промойте клетки 10 миллилитрами PBS-1X. Извлеките PBS-1X и добавьте от двух до трех миллилитров фиксирующего раствора. Через 20 минут снимите раствор фиксации и добавьте в каждую лунку по два миллилитра 0,5%-ного раствора кристаллической фиалки.

Выдерживать при комнатной температуре в течение двух часов. Затем с помощью пипетки осторожно отсасывайте кристаллический фиолетовый раствор. Погрузите пластины в воду из-под крана, чтобы смыть остатки.

Сушка на воздухе при комнатной температуре до двух суток. Затем используйте инвертированный микроскоп с 4-кратным увеличением, чтобы подсчитать колонии, содержащие более 50 клеток. Рассчитайте отношение относительного сопротивления IC50, как указано в текстовом протоколе.

Для начала приготовьте одноклеточную суспензию методом трипсинизации, как указано в текстовом протоколе. С помощью гемоцитометра и окрашивания Trypan Blue подсчитайте клетки. Затем засейте 2,5 раза по 10-5 клеток в колбу Т-25 для каждого условия.

Затем разведите по 12,5 микролитров каждого миРНК-олигонуклеотида миРНК, нацеленного на гены, или олигонуклеотида миРНК отрицательного контроля в минимальной эссенциальной среде для трансфекции. Добавьте реагент для трансфекции катионных липосом в соотношении 1:1 с олигонуклеотидами. Выдерживать при комнатной температуре в течение 20 минут.

После этого добавьте по 700 микролитров трансфекционной смеси в каждую колбу Т-25. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного-трех дней. Используйте ОТ-ПЦР и анализ вестерн-блоттинга для проверки нокдауна генов.

Далее засеиваем клетки в 24 многолуночные культуральные планшеты. Подвергайте клетки воздействию возрастающих концентраций ингибитора целевой терапии со 100 мкг на миллилитр до 400 мкг на миллилитр. Для обеспечения эффективности нокдауна генов олигонуклеотиды миРНК должны быть специфичными для снижения экспрессии мишени.

Разработанные инструменты и измерение миРНК одним и тем же геном-мишенью полезны для этой цели. Инкубировать в CO2-инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 дней. Удалите среду и промойте клетки 10 миллилитрами PBS-1X.

После снятия ПБС добавьте два-три миллилитра фиксирующего раствора. Затем удалите фиксирующий раствор и добавьте 0,5% кристаллический фиолетовый раствор. Выдерживать при комнатной температуре в течение двух часов.

С помощью пипетки тщательно отсасывайте кристаллический фиолетовый раствор. Далее погрузите тарелки в воду из-под крана. Сушка на воздухе при комнатной температуре до двух суток.

После этого с помощью инвертированного микроскопа с 4-кратным увеличением подсчитайте колонии, содержащие более 50 клеток. В этом исследовании три клеточные линии рака желудка, которые экспрессируют высокий уровень HER2 и чувствительны к трастузумабу, выращиваются в питательной среде, содержащей таргетные терапевтические агенты. Из этого получают три субклона, характеризующихся устойчивым фенотипом.

Из субклонов HR NCI N87 считается наиболее устойчивым, достигая относительного сопротивления IC50 28,57. Анализ экспрессии белков и генов подтверждает гипотезу о том, что ген IQGAP1 играет ключевую роль в фенотипе резистентности сублинии HR NCI N87. Как показано на рисунке, уровень белка IQGAP1 в резистентном субклоне в пять раз выше, чем в родительских клетках.

А экспрессия гена IQGAP1 в сублинии HR NCI N87 в 2,5 раза выше, чем в исходном субклоне. Затем проводится сайленсинг гена IQGAP1 для оценки его роли в развитии фенотипа устойчивости к трастузумабу. Клоногенный анализ еще раз подтверждает гипотезу о важности IQGAP.

Как видно на рисунке, сайленсинг гена восстанавливает чувствительность клетки к трастузумабу, снижая значение IC50 до семи микрограммов на миллилитр. То, что я думаю об этой процедуре, важно иметь в виду, что обычно нелегко получить лекарственно-устойчивые клеточные субклоны. И что этот метод несет в себе потенциальный риск неудачи.

С помощью этой процедуры можно получить несколько клеток клонов, характеризующихся различными механизмами, приводящими к приобретенной устойчивости к таргетной терапии. Разработка стандартной процедуры моделирования резистентности к таргетной терапии in vitro должна позволить исследователю-онкологу исследовать новую мишень для преодоления лекарственной устойчивости, что является самой большой критикой методов лечения последнего поколения.