Разработка электрохимических ДНК биосенсора для обнаружения пищевых патогенов

Патогены пищевого происхождения являются причиной возникновения значительной доли проблем общественного здравоохранения во всем мире, которые существенно влияют на уровень смертности и заболеваемости людей. Традиционные методы обнаружения патогенов пищевого происхождения требуют сложной обработки образцов и занимают много времени. В последнее время биосенсоры зарекомендовали себя как перспективный и комплексный метод обнаружения, обладающий преимуществами быстрого обнаружения и практичности.

Разработка биосенсоров основана на модифицированном электроде с наночастицами золота, стабилизированными полимолочной кислотой. Углеродный электрод с трафаретной печатью был модифицирован для увеличения площади активной поверхности рабочего электрода. Метиленовый синий, используемый в качестве окислительно-восстановительного комплекса, имеет прочную связь с одноцепочечной ДНК иммобилизованного зонда.

Эта взаимосвязь высокой аффинности представлена высоким пиковым током. Гибридизация одноцепочечной ДНК с ее комплементарной последовательностью заменяет связанные молекулы метиленового синего, что снижает ток дифференциальной импульсной вольтамперометрии. Возможно, это было связано с меньшим количеством метиленового синего, собранного на поверхности модифицированного электрода с комплементарной двухцепочечной ДНК, что было вызвано недостижимым взаимодействием между основаниями гуанина.

Цвет приготовленных растворов меняется, начиная с желтого на черноватый и в конечном итоге на темно-рубиново-красный. Это указывает на то, что соль золота была восстановлена ионами цитрата. Растворенную полимолочную кислоту смешивали с заранее приготовленным раствором наночастиц золота и затем равномерно перемешивали при комнатной температуре, которая затем обозначалась как стабилизированные полимолочной кислотой наночастицы золота.

Для характеристики стабилизированных полимолочной кислотой наночастиц золота использовали ультрафиолетовую видимую спектроскопию, рентгеновскую дифракцию, просвечивающую электронную микроскопию и полевую эмиссионную сканирующую электронную микроскопию с энергодисперсионной рентгеновской спектрометрией. Около 25 микролитров гомогенного раствора стабилизированных полимолочной кислотой наночастиц золота быстро пипетировали на углеродный электрод, напечатанный методом трафаретной печати, и сушили на воздухе в течение 24 часов перед использованием. Затем модифицированные электроды были электрохимически охарактеризованы в ферроцианиде калия для измерения площади активной поверхности, электрохимической импедансной спектроскопии, повторяемости, воспроизводимости и стабильности.

Оптимизация условий иммобилизации определялась с использованием трех факторов: концентрации одноцепочечной ДНК в диапазоне от 0,2 до 1,4 микромоляра, времени в диапазоне от 30 до 220 минут и температуры в диапазоне от 25 до 75 градусов Цельсия. С другой стороны, оптимизация условий гибридизации определялась двумя факторами: временем в диапазоне от пяти до 35 минут и температурой в диапазоне от 25 до 75 градусов Цельсия. Обработанные модифицированные электроды впоследствии погружали в 20 микромолярного метиленового синего на 30 минут.

Неспецифически абсорбированную ДНК и избыток метиленового синего удаляли промывкой буфером из ацетата физиологического раствора pH 4,5, а затем промывали деионизированной водой. Пиковый ток восстановления метиленового синего измеряли с помощью метода дифференциальной импульсной вольтамперометрии. Измерение дифференциальной пульсвольтамперометрии проводили с использованием фосфатного буфера в физиологическом растворе pH 7,0, который не содержал индикатора.

Аналогичная процедура проводилась для всех взаимодействий. В качестве референтных штаммов Vibrio parahaemolyticus и восемь других бактериальных штаммов, а именно Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus и Vibrio alginolyticus распространенного пищевого патогена в этом исследовании, были использованы для валидации электрохимического биосенсора ДНК. Регулярная субкультура бактериальных штаммов на соответствующих агарах проводилась каждые две недели для поддержания их жизнеспособности.

Количество клеток парагемолитического вибриона определяли с помощью метода спредных пластин. Один миллиметр клеточной культуры бактерии переносили в девять миллиметров триптиказного соевого бульона, содержащего 3% хлорида натрия, для получения коэффициента разбавления 10. Затем 0,1 миллилитра каждого фактора разведения, начиная с 10-10-кратного коэффициента разбавления, наносили на планшет CHROMagar Vibrio для подсчета колоний, соответственно.

Моллюски были получены на мокром рынке, а затем быстро доставлены в лабораторию в холодильнике для льда для анализа. Моллюски были разделены на две группы, а именно обработанные и необработанные, исходя из предположения, что моллюски были собраны равномерно с начала сбора урожая до их размещения в холодильном хранилище на рынке. Моллюски в обработанной группе были предварительно обработаны путем хранения при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 24 часов, после чего подвергались воздействию ультрафиолетового света при температуре 20 градусов Цельсия в течение четырех часов перед экстракцией ДНК.

Ожидалось, что температура замерзания и воздействие ультрафиолета, использованные для контрольной группы, убьют ее или, по крайней мере, ограничат естественно накапливающиеся пищевые патогены в моллюсках. Более высокий режим пастеризации в 70 градусов Цельсия не применялся, так как целью контролируемого условия в этом исследовании было имитировать фактическую ситуацию со свежими моллюсками. Между тем, образцы из необработанной группы были непосредственно проанализированы без какой-либо предварительной обработки сразу после их поступления в лабораторию.

Моллюски промывали в дистиллированной воде и очищали от грязи перед удалением тканей из раковин с помощью стерильных щипцов и ламинарного шкафа. Около 10 граммов образцов тканей моллюска гомогенизировали с помощью гомогенизатора в 19 миллилитрах стерильного соевого бульона триптиказы, содержащего 3% хлорида натрия, в течение 60 секунд. Затем известное количество пищевых патогенов добавляли в девять миллиметров гомогенизированного бульона для образцов с шипами.

Образцы без шипов использовали в качестве отрицательного контроля. Около одного миллилитра образцов было помещено пипеткой в пробирку Эппендорфа для экстракции образцов ДНК, которая будет использоваться для биосенсора и анализа полимеразной цепной реакции. Затем геномная ДНК пищевого патогена была извлечена из образцов с шипами и без шипов.

Геномную ДНК экстрагировали после модифицированной процедуры кипяченого лизиса. Геномную ДНК центрифугировали со скоростью 12 000 оборотов в минуту в течение трех минут при четырех градусах Цельсия для получения прозрачной суспензии, а надосадочную жидкость поддерживали при температуре минус 20 градусов Цельсия для дальнейшего использования. Для определения концентрации и чистоты экстрагированной геномной ДНК использовался биофотометр.

Затем идентичность всех штаммов была определена с помощью стандартных биохимических анализов и верифицирована с помощью секвенирования 16 генов SR РНК. Наконец, геномная ДНК была денатурирована при температуре 92 градуса Цельсия в течение двух минут и быстро охлаждена в ледяной воде перед применением биосенсора. Дальнейшее подтверждение пищевых патогенов было проведено с помощью полимеразной цепной реакции, нацеленной на соответствующий ген.

Амплифицированные продукты и их размеры определяли с помощью электрофореза на 1,5%-ном агарозном геле. Изображения геля были получены с помощью системы документирования геля. Получение наночастиц золота, стабилизированных полимолочной кислотой, было подтверждено по ультрафиолетовым видимым спектрам, рост поверхностной плазмы и резонансный пик которых был основан на глубине около 540 нанометров.

Образование и существование наночастиц золота, стабилизированных полимолочной кислотой, было указано в диапазонах длин волн от 500 до 600 нанометров, в зависимости от размера частиц. Все кристаллитные пики стабилизированных полимолочной кислотой наночастиц золота наблюдались на двух театрах в температурах 31,7, 38,2, 44,4, 64,7 и 77,7 градусов. Интенсивность кристаллитных пиков также увеличивалась по мере того, как более широкие дифракционные пики входили в 31,7 градуса, что указывает на то, что холодные наночастицы были встроены в полимолочную кислоту, и предполагает образование полифазных наноструктур золота.

Из кривой распределения частиц просвечивающей электронной микроскопии и изображений наночастиц золота, стабилизированных полимолочной кислотой, можно увидеть, что наночастицы золота имеют почти сферическую форму. Размер наночастиц находился в диапазоне около 37 нанометров, что немного больше, чем получено из формулы Шеррера, что предполагает поликристаллическую природу синтезированных наночастиц. Основной размер наночастиц золота, стабилизированных полимолочной кислотой, был рассчитан с помощью уравнения Шеррера путем определения ширины 100 брэгговского отражения.

Исходя из таблицы, размер кристаллитов наночастиц золота, стабилизированных полимолочной кислотой, был рассчитан как 27 нанометров. По изображениям, полученным методом сканирования в полевой эмиссионной электронной микроскопии и с энергодисперсионными рентгеновскими спектрами, модифицированный углеродный электрод, напечатанный методом трафаретной печати, имел наибольшую массовую долю золота, наибольшую плотность и наибольшую структуру покрытия наночастицами. Энергодисперсионный рентгеновский спектр подтвердил, что полученные наночастицы золота, стабилизированные полимолочной кислотой, состоят только из золота и не содержат никаких других элементов, кроме пика, соответствующего углероду и кислороду.

Анодные и катодные пиковые потенциалы были постоянными при разных скоростях сканирования, что позволяет предположить, что электрохимическая реакция была обратимой на основе разделения пиков. Площадь активной поверхности модифицированных электродов рассчитывали как 0,26 сантиметра в квадрате и 0,41 сантиметра в квадрате для оголенного электрода и модифицированного электрода соответственно. Этот результат подтвердил, что улучшение, обеспечиваемое стабилизированными полимолочной кислотой наночастицами золота на активной поверхности, было относительно более высоким по сравнению с голым электродом.

Величина сопротивления переноса заряда для оголенного электрода составила 1,932 Ом, в то время как модифицированный электрод уменьшился до 1,444 Ом. Уменьшение значения сопротивления переносу заряда в модифицированном электроде могло быть результатом уменьшения локальной диэлектрической проницаемости и/или увеличения толщины электрического двойного слоя, что позволяет предположить, что ферроцианид калия функционирует за счет поглощения на границе раздела металла или раствора. Пиковые токи постепенно увеличивались при модификации оголенного электрода с использованием наночастиц золота, стабилизированных полимолочной кислотой, что показало, что более высокая чувствительность была обратной противоположностью более низкому сопротивлению переноса заряда.

Относительное стандартное отклонение модифицированного электрода было получено как 4,26%Электрод с модификацией наночастиц золота, стабилизированных полимолочной кислотой, показал лучшее относительное стандартное отклонение после нескольких измерений. Значения относительного стандартного отклонения 4,05% для модифицированного электрода указывают на лучшую воспроизводимость изготовления электрода для наночастиц золота, стабилизированных полимолочной кислотой. Оптимизированная концентрация ДНК составляла 1,2 микромоляра одноцепочечной ДНК.

Оптимальное время иммобилизации одноцепочечной ДНК было выбрано равным 180 минутам. Оптимальная температура иммобилизации одноцепочечной ДНК была выбрана равной 55 градусам Цельсия. Оптимальное время гибридизации двухцепочечной ДНК было выбрано равным 10 минутам.

Оптимальная температура гибридизации двухцепочечной ДНК была выбрана равной 35 градусам Цельсия. Комплементарная ДНК продемонстрировала самый низкий пиковый ток 0,73 мкАмпер среди зондированной ДНК, некомплементарной ДНК, трех оснований несовпадающей ДНК и одного основания несовпадающей ДНК. Очевидно, что высокий ток от ДНК, на которую была направлена, меньше, чем ток других последовательностей олигонуклеотида.

Этот результат показал, что биосенсор может быть использован для различения с высокой чувствительностью и специфичностью. Сконструированный ДНК-биосенсор обладал селективностью детектирования гибридизации с помощью иммобилизованного зонда ДНК на поверхности модифицированного электрода. Непрерывное снижение пикового тока метиленового синего при дифференциальной импульсной вольтамперометрии на модифицированном электроде было вызвано увеличением концентрации комплементарной ДНК.

Линейная корреляция между логарифмом различных концентраций целевой ДНК от 0,2 пикомоляра до 0,02 ммиллимоляра и логарифмом пикового тока восстановления метиленового синего изображена с коэффициентом линейной регрессии, равным 0,96. Процент восстановления изготовленного ДНК-биосенсора медленно снижался до не менее 80% от его первоначального сигнала после шести месяцев хранения, что указывает на высокую стабильность зонда одноцепочечной ДНК на поверхности модифицированного электрода. Хорошая долговременная стабильность при температуре ниже 45 градусов по Цельсию может быть причиной сильной реакции между наночастицами золота, стабилизированными полимолочной кислотой, и одноцепочечной ДНК.

Были проведены скрининг продуктов амплификации полимеразной цепной реакции для девяти различных видов бактерий, таких как Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae и Vibrio parahaemolyticus. Дифференциальный импульсный вольтамперометрический пиковый ток, полученный после оценки перекрестной реактивности, показывает очень четкое обнаружение Vibrio parahaemolyticus по сравнению с другими видами бактерий. Это можно увидеть, уменьшая количество пар оснований, наблюдаемый сигнал дифференциальной импульсной вольтамперометрии увеличивается.

Это связано с большим количеством молекул метиленового синего вплоть до зондов. В результате анализа полимеразной цепной реакции Vibrio parahaemolyticus был обнаружен как в обработанных, так и в необработанных образцах с шипами, как показано на дорожках 7, 8, 9, 10, 11 и 12. В то время как обработанные и необработанные образцы без шипов на первой, второй, третьей, четвертой, пятой и шестой дорожках были лишены парагемолитического вибриона.

Результаты детекции получены с помощью разработанного ДНК-биосенсора, который успешно определил наличие парагемолитического вибриона в исследуемой группе, состоящей из образцов с шипами и без шипов. Эти результаты положительно коррелируют с ранее рассмотренными результатами полимеразной цепной реакции. Применение наночастиц золота, стабилизированных полимолочной кислотой, имеет большой потенциал для применения в качестве модификации для дальнейшего ощущения изготовления.

Высокая селективность может быть достигнута, когда окислительно-восстановительный комплекс сильнее связывается с негибридизованной молекулой биоузнавания, что может быть инновацией, заслуживающей дальнейшего развития.