Стандартный метод стерилизации высок объём Arabidopsis семян

Общая цель этой процедуры заключается в обеспечении стандартизированных условий для успешной стерилизации семян большого числа генотипов Arabidopsis при одновременном предотвращении роста микроорганизмов. Этот метод позволяет стерилизовать сотни образцов семян за один раз, тем самым упрощая критически важный этап подготовки растительного материала в области геномики, протеомики, метаболомики и других высокопроизводительных исследований. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она обеспечивает условия, при которых эффективная стерилизация сочетается с высокой всхожестью для большого количества образцов семян.

Для начала приготовьте 50% раствор отбеливателя с дистиллированной водой. На каждые 200 миллилитров раствора отбеливателя добавьте 50 микролитров моющего средства TWEEN 20. Раствор отбеливателя может храниться до месяца, если он открыт только в стерильных условиях.

Далее апикотируйте 100 семян в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку. Это можно сделать вручную или с помощью специально изготовленного робота для посева. Теперь в вытяжку с ламинарным потоком добавьте к семенам 500 микролитров 50% раствора отбеливателя.

Затем переложите трубки в вращатель и инкубируйте семена в хлорке с легким перемешиванием в течение 10 минут. Через 10 минут отсасывайте раствор отбеливателя из пробирок, удаляя как можно больше. Затем добавьте обратно 500 микролитров стерильной дистиллированной воды и переверните пробирки для перемешивания.

Дайте семенам осесть, затем втяните воду и замените ее другой аликвотой, чтобы снова промыть семена. Выполните в общей сложности шесть таких промывок стерилизованной дистиллированной водой. После того, как семена были тщательно промыты водой, подвесьте их в одном миллилитре воды перед нанесением покрытия.

Перед началом процесса стерилизации рассчитайте объемы отбеливателя и соляной кислоты, необходимые для производства газообразного хлора. Используйте приведенное уравнение для получения рекомендуемого 6%-ного газообразного хлора. Убедитесь, что вы точно рассчитали объем HCl, необходимый для обеспечения успешной стерилизации и предотвращения разбрызгивания.

Обязательно надевайте перчатки и лабораторный халат во время этого протокола и меняйте перчатки всякий раз, когда они смачиваются кислотой или отбеливателем. Под вытяжной шкаф перенесите флаконы с семенами в решетку с открытыми крышками. Затем поместите решетку в пластиковый контейнер, в котором может происходить стерилизация, и приготовьте полоски парафиновой пленки, чтобы приклеить крышку к контейнеру.

Теперь загрузите в стакан 100 миллилитров отбеливателя, а затем поместите внутрь стакан объемом 250 миллилитров. Использование избытка отбеливателя является мерой безопасности, и стакан должен быть как минимум в два раза больше общего объема содержащегося в нем раствора. Кроме того, всегда обрабатывайте отбеливатель и кислоты отдельно.

Далее добавьте в стакан три миллилитра соляной кислоты, а затем сразу же закройте емкость и запечатайте ее парапленкой. Следите за контейнером в течение одного часа, чтобы убедиться, что газ накапливается во время стерилизации. Газообразный хлор должен быть виден либо в виде слабой желтой дымки внутри контейнера, либо раствор может быть проверен на пожелтение.

Периодически проверяйте пломбу на контейнере. Если крышка отшатнулась или парафиновая пленка начала ослабевать, плотно закройте крышку дополнительным слоем парафиновой пленки. После часовой стерилизации откройте угол контейнера, чтобы выпустить газ в течение трех часов.

После трех часов вентиляции закройте все трубочки и храните стерилизованные семена в сухих условиях, пока они не будут покрыты. Теперь нейтрализуйте реакцию, медленно добавляя 1,5 грамма порошка бикарбоната натрия, помешивая стеклянным стержнем, чтобы растворить твердые вещества. Продолжайте добавлять бикарбонат натрия до тех пор, пока пузырьки углекислого газа не перестанут образовываться.

Затем измерьте pH раствора и, при необходимости, добавьте дополнительный бикарбонат натрия, пока pH не станет нейтральным. При условии, что раствор не имеет запаха, его можно утилизировать. В противном случае подождите, пока все запахи рассеются.

Добавьте 500 микролитров стерилизованной дистиллированной воды в каждую трубочку стерилизованных газом семян. Затем высыпьте семена на пластину MS и равномерно распределите их с помощью стерильной одноразовой инокуляционной петли или стерильного наконечника для пипетки. После трех дней стратификации семян при четырех градусах Цельсия перенесите пластины до 23 градусов Цельсия с 16 часами ежедневного воздействия света.

Держите крышки сверху, чтобы корни врастали в среду. После восьми дней роста забейте долю семян, которые проросли. Всхожесть засчитывается, когда радикал вышел за пределы семенной оболочки и видны две семядоли.

Кроме того, подсчитайте количество семян, пораженных плесенью, чтобы определить эффективность условий стерилизации. Четыре различные концентрации отбеливателя при пяти различных временах воздействия были протестированы на семенах дикого типа Columbia. Высокие концентрации отбеливателя отрицательно влияли на всхожесть при слишком большом воздействии.

Тем не менее, высокие показатели всхожести наблюдались при 40 и 50% отбеливателе при всех временах воздействия. Семена, стерилизованные с высокой концентрацией отбеливателя, имели высокую смертность и часто имели дефекты роста, но обычно были полностью свободны от плесени. Было определено, что стерилизация 50% отбеливателем в течение 10 минут обеспечивает оптимальный баланс ингибирования плесени и здорового прорастания.

Чтобы оптимизировать условия стерилизации газообразным хлором, для стерилизации семян дикого типа Columbia в течение двух разных периодов времени использовались три различные концентрации газообразного хлора. Наблюдалась значительная взаимосвязь между временем и концентрацией газа. Через час не наблюдалось никакого влияния на прорастание, в то время как самая высокая концентрация газа была губительной через три часа.

Таким образом, был выбран период стерилизации в один час. Рост плесени эффективно подавлялся трехчасовым воздействием газа или при одночасовом воздействии с использованием 6 или 17% газа. Таким образом, концентрация газа в 6% в течение одного часа была определена как оптимальная для прорастания и ингибирования плесени.

После освоения эта техника может быть использована для успешной стерилизации сотен линий семян в день, если она выполняется правильно. Стерилизованные газом семена также могут храниться в течение длительного периода времени в сухих условиях. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об использовании предоставленных уравнений для расчета необходимых объемов HCl и отбеливателя.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как полногеномные ассоциативные исследования, чтобы связать множество различных генотипов и фенотипов, представляющих интерес. Удачи в ваших экспериментах.