Простой на основе флуоресценции репортер проба для выявления клеточных компонентов необходимых для рицин токсинному цепь (RTA) оборота дрожжей

Общая цель этого простого репортерного анализа на основе флуоресценции заключается в скрининге клеточных компонентов, необходимых для правильного транспорта рициновского токсина А или цепи RTA в модельном организме дрожжей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся межклеточного транспорта рибосомы при активации В-токсина. В нашем случае цитотоксическая субъединица простого токсина рицина из плазматической мембраны в цитосому.

Основным преимуществом данного анализа является возможность быстро и недорого проанализировать влияние отдельного гена дрожжей на транспорт RTA. Начните этот протокол с трансформации клеток, как описано в текстовом протоколе. Инокулируйте пять миллилитров среды LB-канамицина в клетки, содержащие экспрессию RTA плазмиды или пустой вектор.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 220 оборотах в минуту в течение 24 часов. Дополните один литр ЛБ канамицина средним пятью миллилитрами прекультуры. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 220 оборотах в минуту до тех пор, пока ячейки не достигнут оптической плотности на высоте 600 нанометров от 0,8 до 1,0.

После этого снизьте температуру культуры до 28 градусов по Цельсию. Индуцирование экспрессии РТА E.Coli путем добавления IPTG к конечной концентрации в один миллимоляр. Через 3,5 часа при температуре 28 градусов Цельсия и 220 об/мин соберите клетки путем центрифугирования при 10 000 g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Затем промойте гранулу с пятью миллилитрами связующего буфера и разбейте ее при 10 000 г и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Повторив стирку один раз, повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах связующего буфера. Обработайте клетки ультразвуком на льду, используя пять циклов по 15 секунд импульса и 30-секундную паузу.

После центрифугирования клеточного ликата при 21 000 г и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью стерильной шприцевой фильтрующей системы. Используйте автоматизированную систему очистки, оснащенную пятимиллилитровой аффинной колонной на основе никеля, для очистки фракции RTA, маркированной HIS, от стерильного отфильтрованного надосадочной жидкости E.Coli. Как правило, используйте скорость начертания один миллилитр в минуту и охлаждайте всю систему очистки, чтобы предотвратить неэффективное связывание токсинов и потерю активности токсинов.

Кратко уравновесьте столбец сходства с 20 миллилитрами буфера привязки, чтобы удалить буфер хранения. Затем нанесите стерильную, отфильтрованную надосадочную жидкость на аффинную колонку с помощью шприца. Промойте колонку от 25 до 35 миллилитров связывающего буфера, чтобы удалить несвязанные белки из колонки.

Выполняйте этап промывки до тех пор, пока УФ-абсорбенты на 280 нанометрах не приблизятся к начальному значению УФ-излучения. Затем разбавьте связанную фракцию RTA от 20 до 35 миллилитров элюирующего буфера и держите образец на льду. Важно начать отбор проб фракции RTA вскоре после увеличения значения UV, 280 и остановить отбор проб фракции RTA, когда она снова достигнет исходной базовой линии.

Чтобы обессолить ускользающую фракцию RTA, замените аффинную колонну системы очистки на колонну обессоливания и уравновесьте колонку 20 миллилитрами 0,8 молярного сорбита. Нанесите ускользающую фракцию RTA на колонку с помощью шприца. Промойте колонку 100 миллилитрами 0,8 молярного сорбита и разведите обессоленную фракцию RTA в 15-миллилитровой пробирке, как только поглощение ультрафиолета начнет увеличиваться.

Во избежание солевого загрязнения следует останавливаться на отборе проб фракции непосредственно при увеличении проводимости. Храните фракцию Eluded RTA при температуре четыре градуса Цельсия. После трансформации дрожжей, как описано в текстовом протоколе, выберите три разных клона дрожжей с каждой пластины.

Инокулируйте клоны в 100 миллилитров рафинозы при 220 об/мин и 30 градусах Цельсия до оптической плотности при 600 нанометрах от 1,0 до 2,0. Центрифугируйте клетки при температуре 25 градусов Цельсия в течение пяти минут при 10 000 г. После двукратного промывания клеток пятью миллилитрами стерильной воды, повторно суспендируйте клетки в 50 миллилитрах сферопластового буфера.

Инкубируйте культуру объемом 50 миллилитров при 100 об/мин и 30 градусах Цельсия в течение 90 минут. После центрифугирования при 400 г и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут дважды промойте клетки пятью миллилитрами стабилизированной среды рафинозы с выпадением люцина. Затем повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах той же среды, чтобы использовать их непосредственно для измерений репортерного анализа GFP.

Высейте сферопласты дрожжевых клеток в 96 луночных планшетов. В каждую лунку добавляют 70 микролитров стабилизированной среды рафинозы с каплей люцина, содержащей отрицательный контроль, экспрессирующий пустой вектор или очищенный RTA в конечной концентрации RTA пять микромоляров. Добавьте по 70 микролитров стабилизированной среды для выпадения люцина в каждую из оставшихся лунок, чтобы довести их общий объем до 270 микролитров.

Для положительного контроля ингибирования белка добавьте 70 микролитров 0,8 молярного раствора стабилизированного сорбитом G418, так как G418 предотвращает экспрессию GFP в дрожжах. Немедленно добавьте 30 микролитров стабилизированного раствора галактозы, чтобы вызвать экспрессию GFP. Приготовьте дополнительный негативный контроль, добавив 30 микролитров стабилизированной среды рафинозы с выпадением люцина вместо 30% галактозы.

После завершения подготовки образца поместите 96-луночный планшет в флуоресцентный считыватель и подготовьтесь к измерению с помощью набора фильтров 475, 509 нанометров, необходимого для обнаружения флуоресценции GFP. Выполняйте измерения при температуре 30 градусов Цельсия 120 об/мин и диаметре встряхивания один миллиметр в течение 20 часов с интервалом измерения 10 минут. Здесь показан репрезентативный график очистки аффинной хроматографии RTA и контроля пустого вектора.

Синий пик в черном прямоугольнике представляет собой связанную фракцию RTA. Как показано в черном ящике, ни один белок не ускользает из столбца в отрицательном контроле. Здесь показана диаграмма обессоливания аффинной очищенной фракции RTA.

На диаграмме показано разделение белковой фракции RTA и солевой фракции. Результаты окрашивания кумасси после успешной очистки и обессоливания показывают лизат клеток или очищенные образцы различных вариантов РТА. В данном исследовании использовался немодифицированный RTA.

Для валидации флуоресцентного репортерного анализа относительная флуоресценция GFP сферопластов дрожжей дикого типа измерялась в индуцированных и неиндуцированных условиях после 20 часов индукции GFP. Относительная флуоресценция GFP также анализировалась в присутствии RTA, G418 или отрицательного контроля. Относительная флуоресценция GFP также была измерена для выбранных мутантов, в которых, как известно, соответствующие белки участвуют и не участвуют в транспортировке RTA в дрожжах.

Пунктирная линия представляла порог значимости. После того, как экспрессия и очистка RTA будут освоены, результаты анализа флуоресцентного отчета могут быть получены в течение одного дня. Кроме того, этот метод открывает путь исследователям в области инактивации рибосом В-токсинов к изучению корней их интоксикации в эукариотическом модельном организме дрожжей.