Анализируя связь между моноцитов и первичных груди раковые клетки в внеклеточного матрикса экстракт (ECME)-на основе трехмерной системы

Общая цель этого протокола заключается в изучении прямой и косвенной связи между первичными клетками рака молочной железы и моноцитами в трехмерной системе совместного культивирования. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о воспалительном микроокружении рака молочной железы, такие как как перестройка и активация иммунных клеток, как эти клетки помогают поддерживать воспалительное микроокружение опухоли и как это микроокружение способствует инвазии опухолевых клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она представляет собой доступную альтернативу для изучения внутриопухолевой коммуникации и иллюстрирует потенциал in vitro, трехмерных клеточных систем для изучения специфических особенностей биологии опухоли.

Особенно те, которые связаны с агрессией опухоли. Для начала культивируйте два раза по 10 до шестой части моноцитов U937 и THP1 в 10 миллилитров RPMI1640 среды, с добавлением 10-процентного FBS и одного процента антимикотического антибиотика. Также культивируйте свежие ТЧ в DMEMF12 среде.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажной среде с пятипроцентным содержанием углекислого газа. В тарелку четыре раза по 10 до пятой части моноцитов по одному миллилитру на лунку соответствующей им среды. Поместите вкладыш в каждую лунку и добавьте 900 микролитров из четырех умножить на 10 в пятую суспензию клеток BrC в соответствующей среде.

Инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия во влажной среде с 5-процентным содержанием углекислого газа в течение пяти дней и восстановите надосадочную жидкость. Извлекают клетки методом трипсинизации, если проводится последующий анализ. Включите контроль отдельных клеточных культур с соответствующими средами.

Для мечения клеток и моноцитов BrC коммерчески доступными кумерином и родамином перед культивированием клеток готовят монослой из двух умно-10 на интересующую клетку BrC и заменяют стандартную среду достаточным количеством предварительно подогретого рабочего раствора флуоресцентного красителя. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия во влажной среде с 5-процентным содержанием углекислого газа в течение 30 минут. Затем аспирируйте раствор красителя и с помощью достаточного количества XPBS аккуратно промойте клетки.

Отсадите PBS и добавьте стандартную среду. Чтобы трипсинизировать клетки, добавьте в колбу два миллилитра 05-процентного трипсина и 0,48 миллимолярного ЭДТА и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 5-10 минут. Добавьте 200 микролитров FBS для остановки трипсинизации и семь миллилитров соответствующей среды без добавок.

Повторно суспензируйте клетки с помощью пипетирования, затем перенесите 10 микролитров клеток в камеру Нюбауэра и подсчитайте их. Затем гранулируйте клетки при 430-кратном g и комнатной температуре в течение пяти минут, затем выбросьте надосадочную жидкость и используйте три миллилитра предварительно подогретого флуоресцентного рабочего раствора красителя для повторного суспендирования клеток. Инкубируйте клеточную суспензию при температуре 37 градусов Цельсия во влажной среде с пятипроцентным содержанием углекислого газа в течение 30 минут.

После повторного гранулирования клеток выбросьте рабочий раствор красителя и используйте пять-семь миллилитров одного XPBS для мягкой повторной суспензии клеток. Затем, после повторного гранулирования клеток и отбрасывания PBS, повторно суспендируйте клетки в пяти-семи миллилитрах стандартной среды. Посчитайте 10 микролитров клеточной суспензии.

Создайте сокультуру, распределив достаточное количество ECME на дне лунки, чтобы сформировать ровный слой в каждой лунке системы салазок с четырьмя камерами. Планшет 20 микролитров одноклеточной суспензии, содержащей от пяти до 10 до пятой меченых BrC клеток на лунку. Через 15-20 минут при 37 градусах Цельсия добавьте суспензию в 2,5 раза по 10 к пятой меченой моноцитам в 80 микролитрах пробирной среды с добавлением 60-процентной ЭККМ.

Дайте ЭКМЕ застыть при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15–20 минут. Теперь добавьте один миллилитр смеси клеток BrC и моноцитарной питательной среды. Инкубируйте сокультуры при температуре 37 градусов Цельсия во влажной среде с пятьпроцентным содержанием углекислого газа в течение 24 часов, 48 часов или пяти дней, чтобы отслеживать изменения в разные моменты времени.

Чтобы разрушить белки ECM и восстановить клетки из культур, отсадить и отбросить среду, затем добавить в культуру 0,5 миллилитра одного XPBS с 0,1% трипсина и 0,25% ЭДТА. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. После инкубации добавьте 0,5 миллилитра одного XPBS с 10-процентным FBS для нейтрализации трипсина и повторно суспендируйте клетки путем энергичного пипетирования для получения суспензии одной клетки.

После гранулирования клеток выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах одного XPBS с 10-процентным FBS. Повторите этот шаг один раз. Подвергните подвеску ячейки факсу с помощью соответствующего инструмента.

Убедитесь, что конечные популяции имеют чистоту не менее 95 процентов. В каждую лунку восьмилуночной камерной системы выложите 40 микролитров основы ECME и дайте ей застыть при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затравить 800 клеток MCF10 A в лунку по 400 мкл дополненной питательной среды DMEM F12 согласно текстовому протоколу.

Затем добавьте 400 микролитров кондиционированной среды или дополненной питательной среды DMEM F12 с 20 нанограммами на миллилитр человеческого рекомбинантного IL1 beta. Поместите горку камеры в стеклянную чашку Петри, содержащую чашку Петри объемом 35 миллилитров, наполненную двумя миллилитрами PBS. Ячейки MCF 10A следует засеивать в каждую лунку очень медленно, чтобы избежать повреждения основания ECME и предотвратить оседание клеток и образование монолии.

С помощью оптического микроскопа регистрируют образование железистых ацинусов каждые 24 часа в течение 14 дней. После 14 дней культивирования добавьте 100 микролитров 100 наномолярных дапы в один XPBS и инкубируйте образцы при комнатной температуре при постоянном помешивании в течение 25 минут. Промойте образцы одним XPBS при комнатной температуре, три раза по пять минут каждый при постоянном помешивании.

Для крепления препаратов используйте монтажную среду, предназначенную для флуоресцентного окрашивания. Затем запечатайте смонтированные образцы прозрачной полиролью и поддерживайте предметные стекла, защищенные от света на уровне четырех градусов Цельсия. Демонстрировать процедуру в конфокальном микроскопе будет Вадим Перес, научный сотрудник Национальной лаборатории передового микроскопа.

Анализируйте ацинусы с помощью конфокального микроскопа, получая изображения поперечных стеков на разной глубине ацинуса. Визуализируйте различные клеточные белки в ацинусах с помощью правильных протоколов окрашивания. Например, здесь окрашивали кахерен для оценки межклеточной адгезии, полярности клеток и формирования орального полости.

Морфология первичных BrC-клеток, растущих в 3D-культурах с низкой и высокой плотностями, изучалась в течение пяти дней. В течение первых 48 часов клетки прилипают к ЭКМЭ с удлиненным веретенообразным образцом и образуют скрепленные структуры в течение пяти дней. После пяти дней в 3D-кокультурах коммерческие клетки BrC MCF7 и MDA-MB-231 образовали дезорганизованные агрегаты.

Однако агрессивные элементы MDA-MB-231 предназначены для агрегатов с удлиненными формами, в то время как неагрессивные элементы MCF7 предназначены для агрегатов округлых форм, которые более плотно уплотняются, чем элементы MDA-MB-231. Были собраны надосадочные жидкости из непрямого взаимодействия 3D первичных культур BrC и их пятидневных сокультур с первичными моноцитами. Значительно повышенные уровни IL1 бета и IL8 наблюдались в первичных культурах моноцитов клеток BrC.

Как критические, так и воспалительные цитокины, которые ранее были связаны с злокачественным прогрессированием. Клетки MCF10A культивировали с помощью двух различных надосадочной жидкости из двух первичных клеточных линий BrC для наблюдения за формированием просвета как мерой устойчивости к anoykis. В отличие от клеток MCF10A, выращенных в стандартных условиях, биконфокальная микроскопия на 14-й день, поперечные срезы сфероидов показывают, что клетки MCF10A уклонялись от анойкиса, что измерялось путем подсчета количества центральных клеток в ацинусов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как медицинский анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы. Проверьте сигнальные пути при обеих миграциях рака. После его разработки этот метод проложил путь исследователям в области опухолевого микроокружения к изучению коммуникаций клеток рака молочной железы с массовыми клетками, фибробластами, нейтрофилами или даже различными клонами опухолевых клеток в 3D-системах совместного культивирования.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создать систему 3D-культуры для моделирования микроокружения опухоли.