Присоединение бактерий к заводе поверхности измеряется в лаборатории

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении и измерении связывания бактерий с поверхностями растений. Этот метод может ответить на важные вопросы как в патологии растений, так и в безопасности пищевых продуктов. В частности, он может ответить на вопросы о том, как бактерии связываются с поверхностями растений и как их можно удалить.

Главное преимущество этой методики в том, что она проста, быстра и недорога. Чтобы подготовить рассаду, выращенную в воде, поместите небольшое количество семян в стеклянный стакан объемом 30, 50, 100 или 150 миллилитров. Здесь используются семена томатов.

Покройте семена 80% этанолом и быстро перемешайте. Затем дайте семенам впитаться в течение одной минуты. Слейте этанол и погрузите семена в раствор 50% коммерческого отбеливателя и 0,1% Triton X-100 и водопроводную воду.

Дайте семенам замочиться на 20 минут или дольше, если семена крупные, например, семена фасоли. Слейте отбеливающую смесь и трижды промойте семена стерильной водой, давая семенам впитаться в воду на одну минуту для каждой промывки. Высыпьте семена и небольшое количество воды в стерильную чашку Петри и инкубируйте семена в темноте, пока рассада не достигнет нужного размера, от одного сантиметра до 10 сантиметров.

Для подготовки семян или рассады, выращенных в песке, после стерилизации семян и посадочного материала инокулируют семена или рассаду бактериями согласно текстовому протоколу. С помощью стерильного стеклянного стержня сделайте неглубокую лунку в песке, достаточно глубокую, чтобы поместить семена под поверхность. Поместите семя в лунку и засыпьте ее тонким слоем песка.

Затем используйте герметизирующую пленку для герметизации верхней части контейнера, чтобы предотвратить потерю воды и проникновение дополнительных микробов. Выращивайте растения в лаборатории при освещении или в теплице при соответствующей температуре и продолжительности дня для вида и сорта растения. Высадите рассаду в песок.

Используйте стерильный стеклянный стержень, чтобы сделать отверстие. Затем с помощью стерильного крючка из нержавеющей стали осторожно проведите корень в отверстие и с помощью песка заполните боковые стороны отверстия. После инкубации растений с бактериями согласно текстовому протоколу подготовьте образец для микроскопии, поместив его в каплю воды или инкубационной среды на предметное стекло микроскопа и непосредственно наблюдайте за ним.

Если видимых свободных бактерий нет, возможно, произошла бактериальная гибель или связывание бактерий с контейнером, в котором проводилась инкубация. Промойте образец в воде или инкубационной среде, поместив его во флакон с жидкостью и аккуратно перевернув флакон. Затем поместите образец на предметное стекло микроскопа в свежую жидкость для наблюдения.

Для крепления образца используется обычный покровный листок. Если образец толстый и имеет выпуклость, добавьте жидкость и образец в лунку пресса нанесите защитный листок, который имеет кольцо из резины или пластика по краю. Поместите предметное стекло сверху и слегка надавите, чтобы прикрепить защитное стекло к предметному стеклу.

Переверните предметное стекло, чтобы изучить образец. В качестве альтернативы используйте предметное стекло для подсчета водорослей и защитную скольжение аналогичным образом и просматривайте его с увеличением не более чем в 20 раз. Чтобы определить количество жизнеспособных бактерий, обнаруженных на растениях, выращенных в песке, начните с удаления герметизирующего материала с верхней и нижней части контейнера.

Поместите контейнер на лист стерильной бумаги и осторожно постучите контейнер о поверхность, чтобы разрыхлить песок, прежде чем осторожно поднять песок вместе с растением из контейнера. Когда цилиндр с песком и растение окажутся свободными на бумаге, разделите песок посередине, чтобы обнажить корень растения. При желании возьмите образцы песка с края контейнера, а также возле корня.

Это может быть полезно для определения распространения, накопления и роста бактерий. Возьмите корень и удалите песок и бактерии, которые слабо прилипли, опустив корень в отмеренный объем воды или буфера и осторожно встряхнув. Определите жизнеспособное количество клеток бактерий в полученной суспензии, поместив ее на подходящие среды, такие как лурия агар.

Это количество бактерий, слабо связанных с корнем. Наконец, удалите плотно связанные бактерии с помощью ультразвука и определите их количество. На этом графике показано влияние двух различных мутаций целлюлозы минус на способность бактерий колонизировать корни томатов.

Несмотря на то, что стандартные отклонения некоторых измерений достигали 0,9 log основания 10, снижение связывания целлюлозы за вычетом мутантов очевидно. В этом эксперименте измерялось связывание с проростками люцерны дикого типа E.Coli 0157:H7 у мутантов, не способных продуцировать различные экзополисахариды. В обоих штаммах выработка поли-бета-одной шестиглюкуроновой кислоты, или PGA, по-видимому, вносит наибольший вклад в связывание патогенной E.coli с поверхностью растений.

Колановая кислота также играла значительную роль в связывании. Здесь были спроектированы два штамма бактерий, которые не могут связываться с поверхностью растений, чтобы получить PGA, чтобы определить, достаточно ли этого для того, чтобы вызвать связывание бактерий с корнями томатов. В случае A.tumefaciens A1045 PGA заставил бактерии индивидуально связываться с поверхностью корня.

С другой стороны, S. meliloti связывался в большие кластеры, в которых только несколько бактерий были непосредственно прикреплены к корню, а большинство бактерий были прикреплены к другим бактериям. После освоения этой техники она может быть выполнена менее чем за один час для первоначальной настройки, плюс время инкубации и время подсчета от 10 минут до одного часа, в зависимости от образца. При проведении этой процедуры важно помнить, что бактерии могут прилипать практически к любой поверхности.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как наблюдать за связыванием бактерий с поверхностями растений. Определите, где на растении связываются бактерии и определите количество связанных бактерий. Не забывайте, что если вы проводите эти процедуры с человеческими патогенами, процедура может быть чрезвычайно опасной, поэтому всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в капюшоне и ношение перчаток.