Метод для маркировки стенограммы в клетках отдельных кишечная палочка для одной молекулы флуоресценции в Situ гибридизация экспериментов
December 21st, 2017
Эта рукопись описывает метод для маркировки отдельных матричная РНК (мРНК) стенограммы датчиками дневно меченых ДНК, для использования в одной молекулы флуоресценции в situ гибридизация (smFISH) эксперименты в E. coli. smFISH — метод визуализации, который позволяет одновременного обнаружения, локализации и количественной оценки одной молекулы мРНК в фиксированных отдельных ячеек.
Общая цель этого протокола заключается в мечении отдельных транскриптов в E.coli для флуоресцентно меченых ДНК-зондов для визуализации в экспериментах с одной молекулой FiSH. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области системной биологии, такие как характеристика транскриптов от клетки к клеточной способности области интереса. А также транскрипты локализации клеточной стенки.
Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет получить большое количество информации о статистике транскрипционных процессов. Чтобы начать протокол, вырастите E.Coli MG1655 в среде LB в течение ночи в орбитальном шейкере, при 260 об/мин и 37 градусах Цельсия. На следующий день разведите ночную культуру в соотношении один к 100 в свежей среде и измерьте ее оптическую плотность в спектрофотометре с точностью до значения от 0,2 до 0,4.
Затем гранулируйте клетки центрифугированием в течение пяти минут при 4 500 G при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость из всех трубок. Добавьте по одному миллилитру 1XPBS в каждую пробирку и повторно суспендируйте гранулу, чтобы свести к минимуму агрегацию между клетками.
Затем добавьте четыре миллилитра фиксирующего буфера и аккуратно закрутите трубку. Инкубируйте образцы в орбитальном шейкере. Повторно суспендируйте гранулу, чтобы свести к минимуму межклеточную агрегацию, которая может помешать визуализации клеток.
После инкубации гранулируйте клетки, удалите надосадочную жидкость, и добавьте один миллилитр 1XPBS. Переложите суспензии в конические донные микроцентрифужные пробирки объемом 1,8 миллилитров. Гранулируйте клетки методом центрифугирования.
Начните проникновение бактерий с осторожного удаления надосадочной жидкости. Используйте пипетки небольшого объема, чтобы удалить всю жидкость за пределами гранулы. Далее повторно суспендируйте гранулу в 300 микролитрах воды, обработанной ДЭПК.
Добавьте 350 микролитров высококачественного абсолютного этанола и аккуратно перемешайте раствор, перевернув трубку. Добавьте еще 350 микролитров этанола и снова перемешайте. Затем вращайте образец с помощью вращателя пробирки со скоростью 20 об/мин в течение одного часа при комнатной температуре.
Гранулируйте клетки от проникновения. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость. Добавьте к образцам один миллилитр 20%-ного буфера для стирки.
Оставьте их на несколько минут. Далее пеллетные ячейки методом центрифугирования в течение семи минут при температуре 750 G и четырех градусах Цельсия. Удаляйте надосадочную жидкость очень осторожно и используйте пипетки небольшого объема, чтобы удалить всю жидкость за пределами гранулы.
Затем добавьте стоковый раствор набора олигонуклеотидных зондов в буфер для гибридизации аликвоты так, чтобы конечная концентрация олигонуклеотида составила 250 наномоляров, и энергично обведите пробирку. Суспендируйте образцы в 50 микролитрах гибридизационного буфера, содержащего олигонуклеотидные зонды, избегая при этом образования пузырьков. Оставьте образцы на ночь, в темноте, на термоблоке при температуре 30 градусов Цельсия.
Чтобы подготовиться к промывке, приобретите одну новую микроцентрифужную пробирку для каждого образца для визуализации. Добавьте по одному миллилитру буфера для промывки в каждую трубку. Добавьте от 10 до 15 микролитров из гибридизированных образцов в новую пробирку, содержащую буфер для промывки.
Гранулируйте клетки методом центрифугирования. Затем удалите надосадочную жидкость. Промойте образцы еще два раза.
Повторно суспендируйте гранулу в буфере для стирки объемом 25 микролитров. Приготовьте агарозный гель, добавив 150 миллиграммов агарозы к 10 миллилитрам 2X SSC буфера. Каждый раз готовьте раствор в микроволновой печи от 10 до 15 секунд, пока агароза полностью не растворится.
Затем отставьте тюбик остывать на несколько минут. Затем поместите разделительную силиконовую рамку на предметное стекло так, чтобы центр предметного стекла оставался открытым. Поместите жесткое кольцо шириной 10 миллиметров и толщиной от одного до двух миллиметров в центр предметного стекла.
Нанесите небольшое количество геля в центр для запечатывания и подождите несколько минут, пока гель застынет. Затем добавьте еще геля, пока не образуется высокая куполообразная форма. Подождите около 10 минут, чтобы гель застыл и снимите кольцо.
Нанесите 10 микролитров вымытых бактериальных клеток на гель и запечатайте его с помощью предметного стекла с нулевым номером. Храните образец в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивание. Измерения smFiSH клеток E.coli показывают уровень индукции GalK в ответ на переменные внеклеточные концентрации D-фукозы.
Фоновый сигнал отображается удаленным штаммом galK или дельта galK JW0740 в качестве отрицательного контроля. В большинстве клеток видны многочисленные пятна. Соответствует одному или нескольким транскриптам GalK при добавлении двух миллимолярных D-фукоз к бактериальной культуре.
В то время как при отсутствии внеклеточной D-фукозы наблюдается несколько пятен. Другим примером применения этого протокола является ген sodB с флуоресцентными и фазово-контрастными изображениями smFiSH в диком типе или удаленным штаммом JW1648 sodB. Образцы, подготовленные с использованием этого протокола, также могут быть визуализированы с помощью STORM, который позволяет точно определить транскрипты в ячейке.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области системной биологии к изучению статистики транскрипционных событий в отдельных клетках.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот манускрипт описывает метод маркировки индивидуальных транскриптов мессенджерной РНК (мРНК) флуоресцентно-мечеными ДНК-зондами для использования в экспериментах с одномолекулярной флуоресценцией in situ гибридизации (smFISH) в E. coli. Эта техника позволяет одновременно обнаруживать, локализовать и количественно определять отдельные молекулы мРНК в фиксированных отдельных клетках.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Системная биология
- Клеточная биология
Бакground
- Одномолекулярная флуоресценция in situ гибридизации (smFISH) является мощным методом визуализации.
- Этот метод позволяет изучать транскрипционные процессы на уровне отдельной клетки.
- Понимание локализации и количественного определения мРНК важно для системной биологии.
- E. coli служит модельным организмом для этих экспериментов.
Цель исследования
- Маркировка индивидуальных транскриптов мРНК в E. coli.
- Визуализация локализации мРНК с использованием флуоресцентно-меченых ДНК-зондов.
- Улучшение понимания транскрипционной изменчивости между клетками.
Использованные методы
- Выращивание E. coli MG1655 в среде LB на ночь.
- Разведение ночной культуры в свежей среде.
- Измерение оптической плотности для обеспечения правильных условий роста.
- Применение флуоресцентно-меченых ДНК-зондов для анализа smFISH.
Основные результаты
- Успешная маркировка индивидуальных транскриптов мРНК.
- Визуализация локализации мРНК в фиксированных клетках.
- Количественное определение транскрипционных процессов на уровне одиночных молекул.
- Обзор вариабельности экспрессии транскриптов между клетками.
Выводы
- Метод обеспечивает надежный подход для изучения динамики мРНК.
- Он вносит ценную информацию в область системной биологии.
- Эта техника может быть применена к различным исследовательским вопросам, касающимся экспрессии генов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) in E. coli enables direct quantification and spatial mapping of mRNA transcripts at single-cell resolution, addressing key challenges in understanding transcriptional heterogeneity. This capability supports predictive confidence in early discovery by revealing cell-to-cell variability and subcellular transcript localization. The method is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in microbial systems biology and synthetic biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene expression variability across individual bacterial cells.
- Supports mechanistic de-risking by mapping transcript localization and abundance at single-molecule resolution.
- Facilitates functional target validation by distinguishing true biological effects from population-averaged artifacts.
- Provides high-content data for hypothesis-driven pathway analysis in microbial models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of gene regulation or synthetic constructs.
- Delivers reproducible, quantitative mRNA copy number outputs for assay standardization.
- Enables multiplexed transcript detection within single cells, limited by spectral overlap of fluorophores.
- Supports robust evaluation of gene induction or repression in response to experimental perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling precise quantification of gene expression changes in microbial models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for engineered strains or pathway interventions.
- Reduces risk in advancing microbial targets by supplying single-cell resolution data on transcript dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This smFISH labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbial systems, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Delivers direct measurement of transcriptional events and spatial transcript distribution for pathway clarification.
- Screening: Supplies standardized, quantitative readouts for evaluating gene expression modulation in engineered or wild-type strains.
- Analytics: Enables statistical analysis of mRNA copy number distributions and cell-to-cell variability using open-source or custom software.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by validating gene expression changes at single-cell resolution.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for transcript quantification in diverse bacterial systems and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes transcript labeling and imaging for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for microbial targets and synthetic constructs by providing high-resolution expression data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and engineered pathways based on quantitative single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial cell handling, fixation, and fluorescence microscopy.
- Needs access to fluorescence imaging platforms with low-intensity detection and appropriate filter sets.
- Demands cross-team standardization of probe design and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other bacterial strains or gene targets may require probe redesign and spectral optimization.
- Multiplexing is limited by spectral overlap of available fluorophores, constraining simultaneous gene detection.
