Обнаружение и удаление нуклеиназы загрязнения во время очистки рекомбинантных прототип пенистый вирус интеграза

Основная цель данного протокола заключается в выявлении и удалении контаминирующей нуклеазной активности в процессе очистки белков. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области ретровирусологии, касающиеся биохимии, структуры и динамики интеграции. Главным преимуществом данной методики является возможность идентификации и удаления контаминирующей ДН-нуклеазной активности из очищаемого рекомбинантного белка.

Начните с размораживания на льду одной пеллеты E.coli, экспрессирующей прототипную интегразу пенного вируса. Используйте соникатор, оснащенный биорогом диаметром 0,5 дюйма с коническим микронаконечником диаметром 0,125 дюйма, для обработки образца в течение 30 секунд при амплитуде 30%, удерживая пробирку на льду. После соникации перенесите образец клеток в холодную пробирку для ультрацентрифугирования и центрифугируйте при 120 000 ×g в течение 60 минут при температуре four degrees Celsius.

После центрифугирования должен образоваться четко выраженный осадок, а супернатант может иметь желтый цвет. Перенесите супернатант в охлажденную коническую пробирку объемом 50 мл. Затем подготовьте колонку FPLC длиной 110 мм и диаметром 5 мм, заполненную 1,5 мл никель-заряженного сорбента.

Сначала подключите колонку к системе FPLC и подайте буфер. Прибор должен регистрировать данные о проводимости и УФ-поглощении при 280 нанометрах в режиме реального времени. Показания проводимости и УФ-поглощения должны стабилизироваться.

При необходимости продолжайте пропускать буферы через колонку до стабилизации показаний. Используя суперпетлю, нанесите образец белка на колонку со скоростью потока 0.15 milliliters per minute при максимальном пределе давления 0.5 megapascal. Подключите суперпетлю к системе AKTA FPLC.

После промывки колонки и элюирования белков отберите аликвоты по 15 µL из начального проточного объема, промывочной фракции и фракций пика поглощения при 280 нм, затем добавьте к каждому образцу по 15 µL 2X буфера для образцов SDS-PAGE. Прокипятите образцы в течение трех минут. Нанесите по 10 µL каждого образца на 10% гели для SDS-PAGE вместе с четырьмя µL предварительно окрашенных стандартов белка.

Визуально осмотрите гель, чтобы определить фракции, которые, по всей видимости, содержат почти чистую интегразу прототипа пенистого вируса. Объедините эти фракции, зафиксировав объем при дозировании. Обычно он составляет от 8 до 10 milliliters.

С помощью спектрофотометра измерьте УФ-поглощение объединенных фракций при 280 нанометрах и рассчитайте общее количество белка интегразы прототипа пенистого вируса. Типичный выход составляет около 10 milligrams на литр индуцированной культуры. Для удаления гексагистидиновой метки дополните интегразу прототипа пенистого вируса до конечной концентрации 10-millimolar DTT и 0.1-millimolar EDTA.

Затем добавьте 15 µg протеазы 3C человеческого риновируса на 1 mg интегразы прототипа пенистого вируса и инкубируйте при 4 °C в течение ночи. Для проведения фракционирования интегразы прототипа пенистого вируса методом гепарин-аффинной хроматографии снизьте концентрацию хлорида натрия в образце до 200 mM, добавив 1,5 объема буфера С. Затем нанесите разбавленный образец интегразы прототипа пенистого вируса на колонку с гепарин-Сефарозой при скорости потока 0,5 mL/min с максимальным ограничением давления 1 MPa. После промывки колонки и сбора градиента и финальной промывки проанализируйте нанесенный образец, проскок, промывку и фракции с помощью 8% SDS-PAGE.

Затем проанализируйте фракции, окрасив гель кумасси синим. Интеграза прототипа пенистого вируса и загрязняющая нуклеаза обладают различным сродством к гепарин-сефарозному хроматографу. Определите фракции гепарин-сефарозы, которые, по всей видимости, содержат почти чистую интегразу прототипа пенистого вируса, для использования в анализе нуклеазной активности.

Для начала анализа нуклеазной активности смешайте 3 µL фракции гепарина, 50 ng суперскрученной плазмидной ДНК размером 3 kb и реакционный буфер до конечного объема 15 µL. Инкубируйте при 37 °C в течение 90 минут. Остановите реакцию, добавив Proteinase K в концентрации 1 mg/mL и 0,5% SDS, и инкубируйте при 37 °C в течение одного часа.

Затем добавьте 3,5 µL 6X красителя для нанесения в пробы для анализа нуклеазной активности и внесите весь объем в 1% агарозный гель. Проводите электрофорез при 100 В при комнатной температуре в течение одного часа или до тех пор, пока фронт красителя не достигнет конца геля. После завершения электрофореза на снимке геля, полученном с помощью флуоресцентного сканера, должно быть видно, что линейная ДНК мигрирует в соответствии со своим размером — 3 kb, суперскрученная ДНК мигрирует быстрее, примерно до 2 kb, а релаксированная кольцевая ДНК мигрирует медленнее, почти до 3,5 kb.

С помощью программного обеспечения для анализа изображений рассчитайте объем пикселей для суперскрученной, линейной и релаксированной кольцевой форм плазмиды в каждой дорожке. Примите сумму объемов пикселей этих трех форм ДНК за общее значение ДНК и используйте его для расчета процентного содержания линейных и релаксированных колец. Фракции, содержащие загрязняющую нуклеазу, характеризуются более высоким процентом линейных и релаксированных колец по сравнению с отрицательным контролем.

Объедините фракции гепарин-Сефарозы, не проявляющие contaminating nuclease activity, и перенесите их в диализную трубку с порогом отсечения по молекулярной массе 6–8 кДа и диаметром 10 мм. Проводите диализ в течение ночи при температуре 4 °C против одного литра диализного раствора. На следующий день извлеките из диализной трубки очищенный от нуклеаз образец интегразы прототипа пенистого вируса.

Измерьте оптическую плотность при 280 нм и рассчитайте конечную концентрацию белка. Разлейте белок по аликвотам и быстро заморозьте в жидком азоте. Затем храните аликвоты при температуре -80 °C.

Анализ нуклеазной активности проводили в соответствии с описанием в данном видео. Отрицательные контроли включали плазмидную ДНК без белка и предыдущую очистку интегразы прототипа пенного вируса дикого типа, в которой заведомо отсутствовала нуклеаза. В качестве положительного контроля загрязнения нуклеазной активностью использовали предыдущую очистку каталитически неактивной интегразы прототипа пенного вируса, в которой заведомо присутствовала contaminating nuclease.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как биохимический анализ или визуализация одиночных молекул, для получения ответов на дополнительные вопросы, касающиеся, например, кинетики и динамики ферментов. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как выявить и устранить загрязняющую нуклеазную активность в рекомбинантном белке.