Учредительные и индуцибельной систем для генетических в естественных условиях изменения мыши гепатоцитов, используя инъекции Вену гидродинамических хвост

Общей целью этого метода является стабильная трансфекция гепатоцитов in vivo с векторными конструкциями для индуцируемой экспрессии гена или шРНК. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования печени. Например, его можно применять для исследования механизмов рака печени и регенерации.

Основным преимуществом данной методики является комбинированная экспрессия CreER вместе с индуцируемой экспрессией трансгена R shRNA в гепатоцитах мышей in vivo, достигаемая путем гидродинамической инъекции в хвостовую вену. Демонстрировать процедуру будет Эрик Хюбнер, студент-медик из нашей лаборатории. Начните с объединения 150 нанограммов входного вектора, содержащего короткую РНК шпильки для целевого белка, со 150 нанограммами вектора pTC Tet и TE-буфера до общего объема восемь микролитров.

Затем перенесите фермент LR клоназы Mix II на лед и инкубируйте в течение двух минут. Вихрь дважды за время инкубации. Затем добавьте в реакцию два микролитра фермента LR-клоназы Mix II и инкубируйте при температуре 25 градусов Цельсия в течение одного часа.

После инкубации остановите реакцию, добавив один микролитр раствора протеиназы К. Затем выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение десяти минут. Затем преобразуйте компетентные бактерии Stbl3 с помощью двух микролитров смеси для клонирования, используя стандартный протокол теплового шока.

После нанесения трансформации на агаровые планшеты, содержащие ампициллин, инкубировать при температуре 30 градусов Цельсия в течение 24 часов. На следующий день соберите одиночные колонии и засадите небольшие объемы бактериальной среды для инкубации на ночь. После выделения ДНК и подтверждения целостности вектора с помощью секвенирования по Сэнгеру подготовьте максимальные препараты ДНК конструкции для инъекции.

Начните с взвешивания мышей. Затем приготовьте стерильный физиологический раствор, содержащий 15 микрограммов на миллилитр векторной конструкции Sleeping Beauty без эндотоксинов и один микрограмм на миллилитр pchsB5, не содержащих эндотоксинов. Приготовьте достаточное количество раствора, чтобы ввести каждой мыши объем, равный 10% от массы тела.

Наполните стерильный 3-миллилитровый шприц необходимым объемом для одной мыши и прикрепите иглу 27 калибра. Добавив соответствующее количество папиросной бумаги, чтобы оставить минимальное пространство для движения, но достаточно места для дыхания, вставьте мышь в соответствующий ограничитель с отверстиями для дыхания. Согрейте хвост с помощью инфракрасной лампы в течение 30-60 секунд, внимательно наблюдая за признаками перегрева, такими как быстрое движение хвоста или другие признаки возбуждения.

Затем очистите хвост спиртовым тампоном. Вставьте иглу почти горизонтально в одну из двух боковых хвостовых жилок, расположенных близко к основанию хвоста. При успешном введении небольшое количество крови может течь обратно в конус иглы.

Введите весь объем в хвостовую вену в течение восьми-десяти секунд. После инъекции сразу же извлеките мышь из ограничителя. Компрессируйте рану от инъекций стерильной марлей не менее чем на 30 секунд или до тех пор, пока кровотечение не прекратится.

Успешная гидродинамическая инъекция в хвостовую жилу имеет решающее значение для трансфекции и особенно зависит от скорости, объема и времени инъекции. Чтобы облегчить внутривенную инъекцию, убедитесь, что мыши не испытывают стресса или обезвоживания в день инъекции. После 30–60 минут одиночного содержания в клетке для восстановления перенесите мышь обратно в исходную клетку.

Начните индукцию Cre-рекомбиназы через 10–15 дней после инъекции в хвостовую вену, чтобы обеспечить выведение неинтегрированных векторов. Растворите десять миллиграммов тамоксифена в 40 микролитрах этанола и выдерживайте при температуре 55 градусов Цельсия в течение десяти минут, встряхивая. Вортексируйте несколько раз, пока тамоксифен не растворится.

Затем добавьте 960 микролитров кукурузного масла и выдерживайте в течение пяти минут при температуре 55 градусов Цельсия. После остывания наберите раствор в инсулиновый шприц объемом 1 миллилитр с помощью иглы 20 калибра. Затем пересядьте на стрелку 27 калибра.

Чтобы сделать инъекцию, сначала загрифуйте мышь, осторожно взявшись за горлышко мыши большим и вторым пальцами, зафиксировав хвост между основанием ладони и четвертым и пятым пальцами. Затем внутрибрюшинно вводят 0,1 миллилитра раствора в левый нижний квадрант брюшной полости. В экспериментах продолжительностью менее десяти дней непрерывно вводите доксициклин через питьевую воду, используя следующий протокол.

Для начала растворите пять граммов сахарозы в 100 миллилитрах водопроводной воды и автоклав. Затем растворите 100 миллиграммов доксициклина гиклата в пяти миллилитрах раствора сахарозы в 15-миллилитровой конической трубке. Далее с помощью 10-миллилитрового шприца стерильно отфильтровать раствор через фильтр 0,2 микрона.

Затем добавьте отфильтрованный раствор доксициклина к оставшимся 95 миллилитрам раствора сахарозы и подайте раствор мыши вместо питьевой воды. Проверяйте ежедневно и немедленно заменяйте, если раствор помутнел, так как это свидетельствует о чрезмерном бактериальном росте. Приготовьте 1-миллилитровый шприц с иглой 27 калибра с одним миллилитром 4%-ного раствора параформальдегида.

С помощью препарирующих ножниц и анатомических щипцов выполните срединную лапаротомию и обнажите печень усыпленной мыши. Переместите тонкую кишку вправо, чтобы обнажить воротную вену и нижнюю полую вену. Введите иглу подготовленного шприца в нижнюю полую вену и перережьте воротную вену.

Медленно вводите один миллилитр PFA, чтобы пропитать ткань печени и удалить аутофлуоресцентные эритроциты. После удаления печени промойте ее в воде и перелейте до пяти-десяти миллилитров 4%-ного раствора PFA для постфиксации перед разделением. Инъекция транспозонной конструкции, сочетающей конститутивную экспрессию индуцируемой Cre-рекомбиназы с индуцируемой экспрессией трансгена или shRNA по выбору, мышам-репортерам Cre показала устойчивую экспрессию репортерного гена GFP после активации рекомбиназы Cre тамоксифеном.

После лечения доксициклином индуцируемая экспрессия трансгена может быть визуализирована с помощью подходящих антител в трансфицированных гепатоцитах. Для индуцируемой экспрессии shRNA цитоплазматическая экспрессия GFP, обнаруженная с помощью иммуноокрашивания, может быть использована в качестве суррогатного маркера экспрессии shRNA. Была введена транспозонная конструкция, содержащая кассету экспрессии люциферазы под контролем специфичной для печени промоторной конструкции.

После инъекции люциферина мыши были визуализированы с помощью системы визуализации in vivo через две недели после гидродинамической инъекции в хвостовую вену. Визуализация показала надежную и стабильную биолюминесценцию люциферазы в печени через 15 дней после инъекции, продемонстрировав, что система может быть успешно использована для отслеживания присутствия трансфицированных клеток in vivo с помощью биолюминесцентной визуализации. После освоения гидродинамические инъекции в хвостовую вену могут быть выполнены примерно за 15 минут, в то время как вся процедура от клонирования нашей инъекции мышей, индукции экспрессии трансгена R shRNA до подготовки печени займет около трех-четырех недель.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о размере и целостности последовательности плазмид. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как применять систему pTC Tet с выбранной вами трансгенной R-шРНК к любой модели мыши Crelux Pbase.